母胎界面外泌體的生理作用及其參與病理妊娠的研究進展

方 正，董 杰，王曉紅

空軍軍醫大學唐都醫院 婦產科，陜西西安 710032

母胎界面是指蛻膜與胚胎外組織之間形成的結構，是孕期介導母體免疫系統對胎兒產生免疫耐受的重要結構。胎兒側以滋養細胞為中心，在胎兒與底蛻膜之間形成胎盤，是面對母體免疫細胞的“第一道防線”[1]。母體側主要是指底蛻膜，是子宮內膜經過一系列分子事件后蛻膜化形成的特殊類型的組織。母胎界面細胞間的通訊交流在妊娠的建立與維持過程中發揮重要作用。近年來我們更清楚地認識到，外泌體作為一種新型的細胞間通訊工具，參與維持整個孕期的母胎界面穩態，并且在病理妊娠中發生改變。本文對外泌體在母胎界面中生理作用與病理妊娠中改變的相關研究進展做一綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的生物發生 外泌體是直徑30 ～ 150 nm(平均直徑100 nm)的具有磷脂雙分子層膜結構的“茶杯狀”囊泡，在細胞通訊中發揮重要作用[2-3]。幾乎所有的真核細胞都會通過向外“出芽”的方式分泌外泌體[4]。首先，細胞膜內陷形成杯狀結構，這一過程使得細胞膜外側的液體和一些“貨物”如蛋白質、脂類、代謝物、小分子、離子與細胞膜表面蛋白一同進入細胞，形成早期胞內體(early-sorting endosome，ESE)。ESE也可與細胞生物膜系統發生融合，裝載細胞內貨物。隨后，ESE形成晚期內體、多泡小體和管腔內囊泡，同時伴隨外泌體貨物的進一步裝載和自身修飾。最后，管腔內囊泡通過多泡小體錨定蛋白錨定于細胞膜內側，釋放出細胞，形成外泌體[5-6]。在外泌體發生過程中，需要多種蛋白協助，如內吞體分選轉運復合體、多配體蛋白聚糖、凋亡連鎖基因產物2相互作用蛋白X和腫瘤易感基因101等[2,7]。同時，由于細胞膜的參與，CD9、CD63、CD81和CD37等四次跨膜蛋白也表達于外泌體膜，對于外泌體的鑒定具有重要意義。

1.2 外泌體的內容物及其功能 外泌體的內容物包括DNA、RNA、脂質、代謝產物、蛋白質等[5,8]。不同細胞來源的外泌體可攜帶不同的“貨物”，可以用于鑒定其細胞或組織的起源，如胎盤來源的外泌體特異性表達胎盤堿性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，PLAP)[9]。值 得 注意的是，外泌體攜帶的“貨物”與細胞本身內容物的含量并不平行[10]，并且同一細胞產生的外泌體也具有異質性[11-12]，這從側面反映了外泌體是細胞經過選擇后的產物。外泌體富集糖蛋白和跨膜蛋白，包括糖蛋白Ib、P選擇素和整合素等，這可能與外泌體與細胞間通訊的黏附事件相關。除此之外，外泌體攜帶的核酸也在細胞通訊中發揮重要作用。外泌體攜帶長度19 ～ 6 000 nt的至少10種類型RNA。小RNA包括miRNA、tRNA、與PIWI蛋白作用RNA、核小RNA、核仁小RNA以及一些RNA碎片[13-14]。長鏈RNA包括長鏈非編碼RNA、信使RNA、環狀RNA[15]，這三者與miRNA構成內源競爭RNA調控網絡。 miRNA在外泌體調控網絡中處于核心地位。

2 外泌體在母胎界面中的作用

2.1 胚胎來源外泌體促進母胎界面建立免疫耐受和胚胎成功種植 胚胎來源的外泌體最早在牛、小鼠和豬的胚胎培養基中發現[16-17]，之后Giacomini等[18]又在人胚胎培養基中發現。胚胎來源的外泌體富含CD9、CD63和CD81外泌體標志蛋白。除此之外，胎盤來源外泌體具有合體滋養細胞特異性蛋白PLAP和滋養細胞特異性蛋白人白細胞抗原G(human leukocyte antigen G，HLA-G)[19-20]。在母體外周血中，通過上述兩種蛋白可特異性地鑒定分離出胎盤來源外泌體，并且胎盤外泌體的量可用來預測胎兒生長情況，判斷妊娠結局[21]。

輔助生殖技術過程中，Giacomini等[18]在第3天和第5天的人胚胎培養基中發現了含膜結合型和可溶型HLA-G的外泌體，并且在清除培養基中的外泌體后，HLA-G的含量低于檢測下限。這一發現提示我們存在于培養基上清中的絕大多數HLA-G可能是以外泌體或囊泡形式與靶細胞互作的[18]。體外實驗發現，人胚胎來源的外泌體可以被蛻膜內的上皮細胞和基質細胞攝取，重塑局部免疫環境。HLA-G誘導蛻膜髓系來源細胞向耐受性樹突狀細胞分化后，樹突狀細胞將HLA-G呈遞給dNK和M?。在孕早期，dNK含量可由未孕期的20%增長到40%，進入分泌期后，dNK含量可達到70% ～ 80%。與外周血中NK細胞表現出的殺傷作用不同，dNK主要表現為分泌各種細胞因子，如干擾素-γ、血管內皮生長因子、白細胞介素-8等。滋養細胞表達的HLA-C、HLA-E、HLAG與dNK表達的殺傷性免疫球蛋白樣受體(killing immunoglobulin receptors，KIR)結 合，促 進dNK分泌促炎因子和血管生成因子，抑制dNK的細胞毒作用。HLA-G與dNK表面的KIR2DL4受體結合，促進dNK分泌生長因子和細胞因子，促進血管重塑和維持正常妊娠[22]。蛻膜巨噬細胞(decidual macrophages，dM?)占蛻膜免疫細胞的20% ～ 25%，是蛻膜內主要的抗原提呈細胞。HLA-G與dM?表面的免疫球蛋白轉錄子2作用，促進dM?向M2型極化，分泌IL-10、趨化因子CC基元配體2(chemokine C-C motif ligand 2，CCL2)和CCL18，表現出調節免疫和抗炎作用。M?既可以促進螺旋動脈的重建和滋養細胞的侵襲，又可以通過分泌VEGF和基質金屬蛋白酶9促進血管新生和蛻膜組織重構，輔助胚胎成功種植。

研究表明，將胚胎來源的外泌體添加到胚胎培養基中，可以挽救囊胚形成率，提高胚胎質量，促進胚胎后續的生長發育；在小鼠實驗中，胚胎來源外泌體處理過的胚胎可以提高植入率，增強植入能力[23]。

2.2 母體來源的外泌體促進胚胎著床 母體在整個胚胎發育的過程都分泌外泌體促進胚胎發育。在受精卵發育的第一站——輸卵管，外泌體就開始了對胚胎的支持[24]。在牛和小鼠的實驗中，研究者發現輸卵管來源的外泌體中存在多種與細胞代謝、免疫調控和細胞凋亡相關的蛋白。更重要的是，在輸卵管液中存在胚胎營養因子，這提示我們輸卵管參與早期胚胎發育。不僅如此，外泌體因其優越的穿透性和靶向遞送功能，可成功穿越透明帶并被胚胎攝取。研究顯示，外泌體可影響小鼠胚胎卵裂率，促進胚胎細胞增殖，提高胚胎質量，并可延長胚胎體外存活時間[25]。

植入時，胚胎與母體的交流是雙向的。除可溶性細胞因子外，母體蛻膜上皮細胞也分泌外泌體影響胚胎種植。在胚胎植入前，蛻膜上皮細胞外泌體可激活子宮內膜上皮細胞凋亡途徑Bcl-2、Bax、Caspase-3和Tp53基因的表達；而胚胎植入后，外泌體主要上調子宮內膜上皮細胞黏附相關蛋白如Vcam1的表達，輔助胚胎著床后的進一步黏附[26]。除上皮細胞外，人蛻膜基質細胞的外泌體可以上調滋養細胞鈣黏蛋白的表達進而促進侵襲功能[27]；并可以促進內皮細胞成管，可能在血管生成中發揮重要作用。蛻膜來源外泌體的以上作用，體現了蛻膜的容受性和著床中的旁分泌作用。

3 外泌體與病理妊娠

胚胎來源外泌體在病理妊娠中起重要作用。已有研究表明，在妊娠過程中，孕婦外周血中外泌體會大量增加，并且在孕婦外周血中鑒定出了含HLA-G與PLAP的外泌體，這說明孕婦外周血中含有胎盤來源外泌體[28]。在不同疾病中，孕婦外周血中外泌體攜帶的不同貨物的組學分析已經證實其種類和數量的變化可能直接影響靶細胞的功能，導致不良妊娠結局[29-30]。

3.1 外泌體與子癇前期 子癇前期是妊娠期發病率和死亡率最高的疾病，發病率在所有孕婦為5% ～ 7%，每年可造成全世界7萬孕婦和50萬胎兒死亡，也是早產的重要病因之一[31]。但其發病原因尚不明確，有研究認為是胎盤淺著床導致胎盤低灌注，進而導致高血壓和蛋白尿[32]。子癇前期患者與健康患者胎盤外泌體的組學分析發現，子癇前期患者外泌體中具有較高水平的磷脂酰絲氨酸和較低水平的磷脂酸、磷脂酰甘油、神經節苷脂甘露糖苷；并且合胞素2蛋白、基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9等功能蛋白表達量均下降[33-34]。上述蛋白的降低均可影響螺旋動脈的重塑，影響胎兒生長，導致胎盤淺著床和血流量下降，最終導致子癇的發生。在妊娠的前3個月，子癇前期患者血漿外泌體中特定的miRNA可能作為預測疾病的分子標志物。子癇前期患者血漿外泌體中高表達miR-1269[35]，其下調叉頭盒子O1基因(forkhead box O1 gene，FOXO1)的表達，而FOXO1蛋白會影響胚胎著床，可能造成胎盤低灌注[36]；子癇前期患者外泌體中高表達的miR-525-5p[35]可抑制血管活性腸肽進而降低機體抗炎作用，這可能與子癇前期全身小動脈血管內皮炎癥相關。除此之外，在孕晚期子癇前期患者血漿外泌體中，內皮一氧化氮合酶活性降低[37]，導致患者血管調節能力減弱。

3.2 外泌體與妊娠期糖尿病 妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期首次發生糖耐量異常，發生率為13.0% ～ 20.9%，且呈逐年增高趨勢[38]。GDM會導致胎兒處于高糖、高胰島素和缺氧環境中，導致絨毛滋養細胞釋放大量的外泌體[39-40]，并且這些外泌體表現為促炎作用[28]。有研究表明，GDM患者血漿中胎盤外泌體的濃度顯著高于孕周匹配的正常妊娠女性，并且可能與胎兒的體質量呈正相關[41]；并且母胎界面局部外泌體的差異化miRNA表達也會體現在患者血漿外泌體中。GDM患者早孕期血漿外泌體差異化miRNA主要參與胰島素和葡萄糖調節通路，包 括miR-122、miR-132、miR-136、miR-182、miR-210、miR-29和miR-342等[42]；在GDM診斷時(22 ～ 28周)的血漿外泌體中，主要表現為與胰島素敏感度相關蛋白的差異表達，如鈣/鈣調蛋白依賴蛋白激酶2β和妊娠相關血漿蛋白A[43]。GDM患者與正常體質量指數患者血漿外泌體相比，可增加內皮細胞促炎因子的釋放；在小鼠體內實驗中，血漿外泌體改變了骨骼肌miRNA表達譜和胰島素相關通路[44]，提示我們GDM患者血漿外泌體在調節妊娠期葡萄糖穩態中具有重要作用。但考慮到部分GDM患者體質量指數較高，所以可能需要更多的縱向比較數據和母胎界面原位外泌體數據。

4 結語

大量的研究結果證實了母胎界面外泌體可以輔助胚胎種植和維持妊娠，并在妊娠期特有疾病中發生顯著改變。前期的眾多研究數據來源于非靈長類動物或細胞系，較少來源于人的原代組織。因此，如何提取可以更好反映細胞在體情況的外泌體，是我們需要解決的問題。在妊娠期特有疾病中，已經報道了孕婦外周血中胎盤來源外泌體的異常改變，但將其作為生物標志物用于臨床檢測仍需要更多的樣本量來驗證。同時，外泌體還可預測胚胎發育潛能，在可預見的未來，使用外泌體作為標志物進行臨床檢驗，將是一個前景廣闊的重要無創檢測手段。