云南喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物體外抗氧化活性比較

余春慧,王順晶,嚴 亞,楊 旭,楊建云,*

(1.大理大學藥學院，云南 大理 671003；2.大理大學 天然抗氧劑與抗氧化炎癥研究院，云南 大理 671003)

喙尾琵琶甲(BlapsrynchopeteraFairmaire)屬鞘翅目(Coleoptera)擬步甲科(Tenebrionidae)琵琶甲屬(Blapsfabiricus)，在云南地區自然種群1年發生1.0～1.5代，幼蟲9～13個齡期，是云南彝族和白族地區民間廣泛使用的一種藥食兩用昆蟲[1-3]。喙尾琵琶甲成蟲含有豐富的氨基酸，藥用價值及營養價值都較高，其提取物及防御液具有抗菌消炎、抗腫瘤等作用[4-6]，其中多糖提取物具有抗氧化活性[3,7-8]。王奎[9]研究發現，喙尾琵琶甲幼蟲乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌顯示抑菌活性。楊建云等[10]研究發現，喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對DPPH自由基和ABTS自由基具有清除作用。

機體自由基增加或抗氧化能力減弱，會導致機體氧化與抗氧化系統失衡，抗氧化防御機制失衡會產生氧化應激，過度的氧化應激會導致氧化炎癥[11]。昆蟲種類和數量龐大，生理結構特殊，具有超強氧化應激機制，其體內存在各種內源化合物，具有抗氧化作用[12]。黃粉蟲黃酮提取物，白蠟蟲多糖提取物，金蟬、蠶蛹、蜂蛹、蝗蟲、竹蟲、柴蟲和水蠆(蝦巴蟲)的醇提物等都具有體外抗氧化活性[13-15]。喙尾琵琶甲成蟲具有獨特的生物學特性，壽命長，產卵量大，為其幼蟲開發為天然抗氧化劑提供了條件[1,12,16]。

作者以人工飼養的云南喙尾琵琶甲幼蟲為材料，采用不同極性的溶劑提取其活性成分，通過測定DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率評價喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物的體外抗氧化活性，為開發利用云南喙尾琵琶甲幼蟲提供基礎研究數據。

1 實驗

1.1 材料

從野外環境中采集喙尾琵琶甲成蟲，室內交配產卵后，收集卵，參照文獻[17-18]方法飼養，收集鮮活喙尾琵琶甲幼蟲，冷凍干燥。

1.2 試劑與儀器

DPPH自由基(1,1-二苯基-2-苦基肼)，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；ABTS[2,2′-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二銨鹽]、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸(VC)，國藥集團化學試劑有限公司；正己烷、乙酸乙酯，天津風船化學試劑科技有限公司；甲醇，太倉滬試試劑有限公司；實驗用水為超純水。

SCIENTZ-10N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；LG10-2.4A 型高速離心機，北京醫用離心機廠；722N型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；PX224ZH型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；純水儀。

1.3 方法

1.3.1 不同溶劑提取物的制備

稱取鮮活喙尾琵琶甲幼蟲300 g，冷凍干燥得到干蟲體146 g，用研缽磨碎，放入250 mL錐形瓶中。首先加入正己烷200 mL，超聲5 min，靜置20 min，傾出上清液；浸提3次，合并浸提液，抽濾，棄去濾渣，得到喙尾琵琶甲幼蟲正己烷浸提液。

蟲體殘渣揮發干燥后，同正己烷浸提方法，依次用乙酸乙酯、甲醇、超純水分別浸提。將不同溶劑浸提液用旋轉蒸發器減壓濃縮成浸膏，溶劑揮發后得不同溶劑提取物，稱重，提取率按式(1)計算：

(1)

1.3.2 DPPH法測定喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物抗氧化活性

DPPH自由基工作液的制備：配制濃度為6.25～50 mg·L-1的DPPH自由基溶液，繪制DPPH自由基標準曲線；以50 mg·L-1的DPPH自由基溶液為樣品測定的工作液。

DPPH自由基清除率的測定：稱取喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物0.12 g，用15 mL甲醇溶解，依次稀釋至提取物濃度為0.062 5～4 mg·mL-1，即得樣品溶液。取2 mL樣品溶液，加入 2 mL DPPH自由基工作液，混勻，30 ℃暗室放置30 min，測定517 nm處吸光度[10,19]；以等濃度的VC為對照。DPPH自由基清除率按式(2)計算：

(2)

式中：Ai為樣品溶液+DPPH自由基工作液體系的吸光度；Aj為樣品溶液+甲醇體系的吸光度；A0為甲醇+DPPH自由基工作液體系的吸光度。

1.3.3 ABTS法測定喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物抗氧化活性

ABTS自由基工作液的制備：將7 mmol·L-1的ABTS自由基溶液和2.45 mmol·L-1的K2S2O8溶液按體積比1∶1混合，4 ℃避光靜置15 h，得到ABTS自由基母液；用無水乙醇稀釋40倍至734 nm處吸光度為0.70±0.02的工作液。

ABTS自由基清除率的測定：將1 mL 樣品溶液和3 mL ABTS自由基工作液在25 ℃下反應30 min，測定734 nm處吸光度[10]；以等濃度的VC為對照。ABTS自由基清除率按式(3)計算：

(3)

式中：Ai為樣品溶液+ABTS自由基工作液體系的吸光度；Aj為樣品溶液+甲醇體系的吸光度；A0為甲醇+ABTS自由基工作液體系的吸光度。

1.3.4IC50值的計算

通過SPSS軟件計算喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的IC50值。

1.4 數據處理

采用Excel制圖，利用Graphpad Prism 5軟件進行差異顯著性分析。P<0.05為顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物的提取率

分別以600 mL正己烷、乙酸乙酯、甲醇和超純水依次提取146 g喙尾琵琶甲幼蟲干蟲體，得到對應提取物質量分別為19.36 g、16.25 g、9.74 g和2.56 g，提取率分別為13.26%、11.13%、6.67%和1.75%。

2.2 DPPH自由基標準曲線(圖1)

由圖1可知，DPPH自由基濃度在0～50 mg·L-1范圍內與吸光度線性關系良好，線性方程為：y=0.0228x+0.012，R2=0.9997。

圖1 DPPH自由基標準曲線Fig.1 Standard curve of DPPH free radicals

2.3 DPPH法測定喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物抗氧化活性結果(圖2)

由圖2可知，當水提物濃度為1 mg·mL-1時，對DPPH自由基清除率達到91.27%±0.25%；當水提物濃度增至4 mg·mL-1時，對DPPH自由基清除率保持在90%左右，IC50值為0.226 mg·mL-1。隨著甲醇提取物濃度的增加，其對DPPH自由基的清除能力逐漸增強；當甲醇提取物濃度為1 mg·mL-1時，對DPPH自由基清除率為36.72%±0.66%；當甲醇提取物濃度為4 mg·mL-1時，對DPPH自由基清除率達到91.43%±0.09%，IC50值為1.032 mg·mL-1。正己烷提取物和乙酸乙酯提取物濃度為1 mg·mL-1時，對DPPH自由基清除率分別為3.50%±0.74%和4.13%±0.28%；濃度為4 mg·mL-1時，對DPPH自由基清除率分別為9.34%±1.80%和8.66%±2.03%，均顯著低于水提物和甲醇提取物。

圖2 喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力Fig.2 Scavenging ability of different solvent extracts from larvae of Blaps rynchopetera Fairmaire against DPPH free radicals

4種提取物中，水提物的IC50值最小；當提取物濃度在0.062 5～3 mg·mL-1范圍內時，水提物對DPPH自由基清除能力高于甲醇提取物；當提取物濃度在4 mg·mL-1時，水提物和甲醇提取物對DPPH自由基清除率都達到90%以上，對DPPH自由基清除能力與VC相近，略低于VC。正己烷提取物和乙酸乙酯提取物對DPPH自由基清除能力相對較弱。

2.4 ABTS法測定喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物抗氧化活性結果(圖3)

由圖3可知，當水提物濃度為0.5 mg·mL-1時，對ABTS自由基清除率為91.05%±0.39%，IC50值為0.159 mg·mL-1。當甲醇提取物濃度為0.5 mg·mL-1時，對ABTS自由基清除率為57.74%±1.22%，濃度增加到1 mg·mL-1時，清除率為81.90%±1.08%，IC50值為0.20 mg·mL-1。正己烷提取物和乙酸乙酯提取物對ABTS自由基清除能力相對較弱，在濃度為4 mg·mL-1時，對ABTS自由基清除率分別為8.41%±1.22%和14.13%±6.70%。

圖3 喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物對ABTS自由基清除能力Fig.3 Scavenging ability of different solvent extracts from larvae of Blaps rynchopetera Fairmaire against ABTS free radicals

當水提物濃度在1～4 mg·mL-1范圍內時，對ABTS自由基清除能力與VC相當，略強于VC;當甲醇提取物濃度在2～4 mg·mL-1范圍內時，對ABTS自由基清除能力與VC相當，略強于VC。

3 結論

采用DPPH法和ABTS法對人工飼養的喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物的體外抗氧化活性進行評價。當提取物濃度在0.062 5～4 mg·mL-1范圍內時，隨著提取物濃度的增加，其對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力增強；在相同濃度下，水提物和甲醇提取物的抗氧化活性顯著高于正己烷提取物和乙酸乙酯提取物的。水提物和甲醇提取物濃度在4 mg·L-1時，對DPPH自由基清除能力與VC相近，略低于VC；水提物和甲醇提取物濃度分別在1～4 mg·mL-1、2～4 mg·mL-1范圍內時，對ABTS自由基清除能力與VC相當，略強于VC。

本研究首次對完全人工飼養的喙尾琵琶甲幼蟲不同溶劑提取物的抗氧化活性進行比較，為喙尾琵琶甲幼蟲的利用提供了數據支持，對探索喙尾琵琶甲幼蟲抗氧化活性成分的有效提取具有重要意義。