顏子淵 鄧真德 張 競 梁振業 徐 暢

(海南大學海洋學院, 海南省水產種業工程研究中心, 海南省熱帶水生生物技術重點實驗室, 海口 570228)

近年來, 我國由于近岸工廠大量排放未經處理的尾水, 導致地表水生態系統的重金屬污染日益嚴重[1], 銅已經成為我國湖泊富集重金屬的主要元素之一[2]。有報道稱, 珠江口海域銅濃度已處于污染水平, 且具有潛在的生物毒性[3]。Jiang等[4]對太湖水體、間隙水和表層沉積物中的重金屬含量進行詳細調查, 研究表明, 太湖間隙水水體銅濃度為2.29—135.78 μg/L, 在珠山灣濃度最高。Kshetriya等[5]對印度梅加拉亞邦天然水體中重金屬污染進行評估,季風期的西杰因蒂亞丘陵(West Jaintia Hills)銅污染嚴重, 銅濃度為416 μg/L。在水產養殖過程中, 硫酸銅通常用于預防刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)感染, 并能夠有效地清除有害藻類。在池塘管理中過量使用硫酸銅, 可能會因為銅在池塘底泥中的積累而危及水環境的安全[6]。池塘養殖魚類投喂飼料中帶來的銅也會沉到底泥并富集, 通過食物鏈最終進入魚體[7]。銅是魚類生命生長過程中必需的一種微量元素, 是構成酶的活性基團及組成部分,但當其濃度超過生態閾值時, 必然會對魚體造成一定的影響[8,9]。銅對魚類的毒性作用是多方面的,如食欲降低[10]、肝細胞損傷[11]、血細胞減少[12]、誘導組織抗氧化損傷和應激反應[13]、影響魚類的生長[14]、代謝酶活性[15]、胚胎發育[16]和生殖[17]等。銅對水生生物的毒理作用主要是通過Haber/Weiss反應催化自由基的產生[18], 過量的自由基會導致DNA的斷裂和脂質過氧化等[19], 從而增加機體氧化脅迫, 誘發多種損傷[20], 甚至引起死亡[21]。有研究表明, 不同種的魚類會對銅具有不同的生理響應機制[22]。可見, 研究環境銅對魚類生長、健康和脂代謝的影響對其生產具有重要的意義。

目前, 有關水環境重金屬對魚類健康和脂代謝的影響已有諸多報道。Huang等[23]研究發現水體銅暴露影響矛尾復鰕虎魚(Symechogobius hasta)的肝臟脂質沉積和代謝。Mazandarani等[24]報道稱, 在高濃度水體硫酸銅暴露下, 鯉(Cyprinus carpio)血漿甘油三酯和膽固醇含量顯著升高。Liu等[15]研究表明矛尾復鰕虎魚暴露于亞急性銅后, 其肝臟中脂肪含量顯著升高, 且脂蛋白脂酶和肝脂酶的活性顯著下降。Chen等[25]發現, 黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)在不同濃度梯度的水體銅(2、24、71和198 μg/L)暴露6周后, 高濃度銅降低其肝臟脂肪合成酶活性和基因的表達水平, 但脂蛋白水解酶的活性及其mRNA表達水平顯著提高。Tulasi等[26]發現, 攀鱸(Anabas testudineus)在暴露于濃度為5 mg/L的水體鉛環境中30d后, 其肝臟總脂肪含量降低, 而游離脂肪酸含量升高。Zheng等[27]報道稱, 黃顙魚在低濃度鋅水體中(0.05、0.35和0.86 mg/L)暴露8周后, 鋅離子會通過抑制脂解代謝和促進脂肪生成反應而誘導脂質的蓄積。Yang等[28]研究發現, 河南華溪蟹(Sinopotamon honanense)在水環境鎘暴露后, 肝胰腺中的脂蛋白脂酶活性顯著下降, 其組織中的脂質水平也明顯降低。盡管已有很多關于環境重金屬對魚類脂代謝影響的研究, 但有關羅非魚在銅脅迫下脂代謝的報道卻非常有限。

羅非魚是世界上最具有經濟價值和養殖價值的淡水養殖物種之一[29]。其中, 吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)因生存能力強、生長速度快、凈出肉率高而在我國大面積推廣[30]。近年來由于高密度精養模式發展, 長期投喂高脂肪、高能量的飼料, 使實際生產出的羅非魚出現肝臟及腹腔脂肪蓄積現象[31,32]。同時, 羅非魚清晰的基因和生物學基礎, 也是研究水體環境對硬骨魚類生理和健康影響的優質模式物種。目前有關水體銅暴露對羅非魚的影響已有許多報道, 但主要聚焦于對其生長表現[14]、抗氧化系統[33]、免疫能力[34]、滲透調節[35]和離子平衡[36]等方面, 對脂代謝影響的相關研究較少。因此,本研究以羅非魚為對象, 研究不同濃度銅暴露對羅非魚的肝胰臟脂代謝及血清脂代謝的影響, 為進一步研究水體銅對羅非魚毒理作用提供了數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗對象為幼體吉富羅非魚(GIFT tilapia,Oreochromis niloticus), 魚苗購置于海南省文昌市某羅非魚繁育公司。實驗開始前將魚苗在室內養殖缸環境中暫養1周, 暫養過程中采用商用飼料定時飽食投喂, 在暫養結束后, 將平均體重為(0.45±0.02) g的健康羅非魚苗隨機分配至養殖水箱中, 開始正式的養殖實驗。

1.2 實驗管理

根據前人的研究發現, 羅非魚在水中硫酸銅暴露96h的半致死濃度為7.98 mg/L[37], 選擇半致死濃度的1/10作為安全濃度(0.8 mg/L)。故養殖實驗設置水體銅暴露濃度分別為0、0.2 、0.4 和0.8 mg/L,未添加硫酸銅的水體作為實驗的對照組, 每個實驗組設置3個實驗重復。每個養殖水箱(60 cm×30 cm×35 cm)隨機分配幼魚15尾。以硫酸銅(CuSO4·5H2O,分析純)作為銅源, 將其溶解在去離子水中配制成母液, 通過移液槍加入固定體積的母液至已知體積的水體中, 保持水體的銅濃度。在養殖過程中, 每日投喂3次, 投喂時間分別為7:00、12:00和20:00,飽食投喂, 且根據羅非魚攝食情況進行調整。每日每缸更換1/2充分曝氣的養殖用水, 并補充相應體積的銅溶液, 每隔4天更換全部養殖水體, 以確保水體中銅濃度的穩定。養殖期間水溫控制在27—30℃, pH 7.5—8.0, 持續充氣保證溶解氧不低于5 mg/L, 實驗周期為4周。

1.3 樣品采集

采樣前, 羅非魚禁食24h。將魚麻醉后, 計算存活率, 并稱量每條魚體的重量, 計算增重率和特定生長率。每缸中隨機取8尾魚, 進行尾靜脈取血, 血樣在室溫靜置4h后, 轉移至4℃冰箱過夜, 次日將血樣在低溫離心機中以4℃, 3000 r/min離心10min(3-18KS, Sigma,德國), 取上層血清分裝于200 μL離心管中, 轉至?80℃保存待測。在冰上快速分離羅非魚的肝胰臟和脾臟, 肝胰臟稱重以計算肝體指數,切取肝胰臟和脾臟的固定部位組織塊固定于4%多聚甲醛, 用于制備組織石蠟切片(HE染色)。

1.4 指標測定

生長指標測定:

羅非魚的存活率、增重率、特定生長率和肝體比采用下列公式進行計算:

存活率(Survival rate, %)=最終魚數量/初始魚數量×100

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=(最終重量?初始重量)/初始重量×100

特定生長率(Specific growth rate,SGR, %/d)=(ln最終重量?ln初始重量)/實驗天數×100

肝體比(Hepatosomatic index,HSI, %)=肝胰腺重量/體重×100

肝胰臟生化指標測定: 在肝胰臟解凍后, 準確稱取組織重量, 按照重量(g)﹕體積(mL)=1﹕9的比例加入預冷的生理鹽水, 在冰水浴的條件下, 制備成10%的組織勻漿, 在4℃, 3000 r/min離心10min(3-18KS, Sigma,德國), 取上清液分裝至200 μL的離心管中, 甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、總可溶性蛋白含量和HMG-CoA還原酶活性均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定, 測定的過程按照試劑盒中的說明書要求進行操作。

血清脂質成分測定: 高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(T-CHO)含量均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定, 具體測定方法按照試劑盒說明書進行。

血清免疫指標測定: 谷丙轉氨酶(GPT)和谷草轉氨酶(GOT)活力均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定, 具體測定方法按照試劑盒說明書進行。

組織學觀察: 肝胰臟和脾臟組織用鋒利的解剖刀切取固定部位后, 在4%多聚甲醛中固定24h后,經不同濃度的乙醇進行逐級脫水、經過二甲苯清潔透明后用石蠟包埋固定于包埋盒中, 進行組織切片, 石蠟切片厚度為5 μm。用蘇木精和伊紅對載玻片上的石蠟組織進行染色, 清洗掉多余染料烤干,再用樹脂進行封片保存。將封好的石蠟切片于光學顯微鏡(Eclipse 200, Nikon, 日本)下觀察, 并用圖像分析軟件(SBI image 2.0, 賽寶, 中國)進行拍攝記錄。

1.5 數據分析

本實驗中的全部數據均采用SPSS statistics 23(IBM, Armonk, 美國)進行統計分析。所有數據均為平均數±標準誤(mean±SE)表示。對照組、0.2、0.4和0.8 mg/L 實驗處理組之間的差異使用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示為顯著差異,P<0.01表示為極顯著差異。

2 結果

2.1 生長性能

0.2 mg/L處理組羅非魚的存活率和特定生長率均顯著高于0.4和0.8 mg/L處理組(P<0.05), 但與對照組相比無顯著差異(P>0.05; 圖 1A和1C)。由圖 1B可知, 水體銅處理實驗組羅非魚的增重率均顯著低于對照組(P<0.05)。0.4和0.8 mg/L組羅非魚肝體比顯著高于0.2 mg/L組和對照組(P<0.05), 0.4和0.8 mg/L實驗組之間無顯著差異(P>0.05), 0.2 mg/L組羅非魚肝體比與對照組相比雖有下降, 但無顯著差異(P>0.05;圖 1D)。

圖1 水體中不同濃度銅對羅非魚存活率(A)、增重率(B)、特定生長率(C)和肝體比(D)的影響Fig. 1 Effects of different waterborne Cu concentrations on the survival rate (A), weight gain rate (B), specific growth rate (C) and hepatosomatic index (D) of tilapia柱狀圖中不同字母上標表示組間具有顯著性差異(P<0.05), 且d>c>b>a, 下同Different letters mean significant difference (P<0.05), and d>c>b>a, the same applies below

2.2 肝胰臟脂質代謝

隨著水體銅濃度升高, 肝胰臟中的甘油三酯含量在0.4和0.8 mg/L組中顯著升高(P<0.05), 0.2 mg/L組羅非魚肝胰臟甘油三酯含量與對照組無顯著差異(P>0.05; 圖 2A)。0.2 mg/L組羅非魚肝胰臟可溶性蛋白質含量顯著高于其他各組(P<0.05), 其他各組之間無顯著差異(P>0.05; 圖 2C)。各實驗組羅非魚肝胰臟總膽固醇含量和HMG-CoA還原酶活力與對照組相比均無顯著差異(P>0.05; 圖 2B和2D)。

圖2 水體中不同濃度銅對羅非魚肝胰臟中甘油三酯(A)、總膽固醇(B)、蛋白質(C)和HMG-CoA還原酶(D)的影響Fig. 2 Effects of different waterborne Cu concentrations on the contents of triglycerides (A), total cholesterol (B), protein (C) and HMGCoA reductase (D) activity in hepatopancreas of tilapia

2.3 血清脂質代謝

各實驗組羅非魚血清中HDL-C與對照組相比無顯著差異(P>0.05; 圖 3A)。0.4和0.8 mg/L組魚體血清中LDL-C顯著高于0.2 mg/L組和對照組(P<0.05),0.4和0.8 mg/L組之間、0.2 mg/L和對照組之間均無顯著差異(P>0.05; 圖 3B)。0.8 mg/L組魚體血清中甘油三酯含量顯著高于0.2 mg/L組(P<0.05), 對照組、0.2和0.4 mg/L組之間, 對照組、0.4和0.8 mg/L組之間均無顯著差異(P>0.05; 圖 3C)。0.4和0.8 mg/L組魚體血清中T-CHO的含量均顯著高于0.2 mg/L組和對照組(P<0.05), 0.4和0.8 mg/L組之間、0.2 mg/L組和對照組之間均無顯著差異(P>0.05; 圖 3D)。0.8 mg/L組血清中GPT顯著高于0.2和0.4 mg/L組(P<0.05),與對照組相比差異不顯著(P>0.05), 對照組、0.2和0.4 mg/L組無顯著差異(P>0.05; 圖 3E)。0.8 mg/L組魚體血清GOT顯著高于對照組(P<0.05), 但0.2、0.4 mg/L組與對照組相比無顯著差異(P>0.05; 圖 3F)。

圖3 水體中不同濃度銅對羅非魚血清中高密度脂蛋白膽固醇(A)、低密度脂蛋白膽固醇(B)、甘油三酯(C)、總膽固醇(D)、谷丙轉氨酶(E)和谷草轉氨酶(F)的影響Fig. 3 Effects of different waterborne Cu concentrations on the contents of high-density lipoprotein cholesterol (A), low-density lipoprotein cholesterol (B), triglycerides (C), total cholesterol (D), alanine aminotransferase (E) and aspartate aminotransferase (F) activity in serum of tilapia

2.4 肝胰臟組織學

水環境銅暴露后, 羅非魚肝胰臟組織學發生了明顯的變化(圖版Ⅰ)。與對照組相比, 0.2 mg/L組魚體的肝胰臟細胞結構顯示正常, 空泡數量與對照組相比無顯著差異(圖版Ⅰ-1, 2)。在0.4和0.8 mg/L組, 羅非魚肝胰臟組織空泡數量顯著增加, 肝胰臟細胞結構也呈現不規則形態(圖版Ⅰ-3, 4)。

2.5 脾臟組織學

脾臟組織學切片結果顯示, 當羅非魚暴露于0.2 mg/L銅水體后, 脾臟中開始出現小面積的巨噬細胞中心(MMCs), 脂褐素的積累也明顯多于對照組(圖版Ⅱ-1, 2)。在0.4和0.8 mg/L 銅處理組中, 羅非魚MMCs面積明顯增大, 脂褐素的蓄積也隨著環境銅離子濃度升高而增加(圖版Ⅱ-3, 4)。

圖版Ⅱ 水體中不同濃度銅暴露后羅非魚脾臟HE染色切片PlateⅡ Spleen histology of tilapia exposed to different waterborne Cu concentrations

3 討論

3.1 水體中不同濃度銅離子暴露對羅非魚生長性能的影響

大量研究表明, 魚類通過水體或食物攝入過多的銅離子均會抑制其生長性能。在本實驗中, 隨著銅離子濃度的升高, 羅非魚的增重率、特定生長率和存活率均受到顯著的抑制。這與Ali等[14]研究結果一致, 在銅離子濃度為0.15、0.3和0.5 mg/L的水體中, 尼羅羅非魚的增重率和特定生長率相比于對照組顯著下降, 且與水體中銅離子濃度增加呈線性正相關。王春秀[38]研究表明, 當水體中銅離子濃度大于0.3 mg/L時, 黃河鯉(Cyprinus carpio)的增重率顯著降低。同時, Liu等[15]對矛尾復鰕虎魚的研究發現, 當水體中銅離子濃度為0.15和0.3 mg/L時, 矛尾復鰕虎魚的增重率、特定生長率以及存活率顯著下降。已有研究表明, 水體銅暴露使魚體生長性能的下降可能有兩個原因, 首先是銅暴露使魚體用于解毒和維持體內平衡的代謝支出增加[39], 其次是銅暴露使其攝食量減少, 從而導致其生長減慢[10,14]。羅非魚作為重要的淡水魚之一, 能耐受各種環境因素和應激條件[40], 在本研究中, 高濃度銅使羅非魚生長受到了嚴重的抑制, 可能由于羅非魚是熱帶魚類, 環境中較高的水溫增加了組織中銅的積累[41]。

3.2 水體中不同濃度銅離子暴露對羅非魚肝胰臟脂代謝的影響

肝臟在脂質代謝中起著重要的作用[27], 水體中重金屬暴露能夠使魚類脂代謝功能失調[42]。甘油三酯是脂肪的主要成分, 甘油三酯含量升高表明肝臟中脂肪的分解代謝較低[43]。在本實驗中, 0.4和0.8 mg/L實驗組羅非魚肝胰臟中甘油三酯的含量與對照組相比顯著升高, 而0.2 mg/L組甘油三酯含量稍微下降, 血清中甘油三酯含量的變化趨勢相同,這可能是脂肪合成分解相關基因受到環境重金屬的影響的原因[9,44]。黃超[45]的報道稱, 經30d水體銅暴露后, 蝦虎魚肝臟脂肪含量顯著增加, 但是水體銅暴露60d后, 魚體肝臟脂肪的含量下降。相反,Levesque等[46]研究表明環境銅暴露降低黃金鱸(Perca flavescens)肝臟中甘油三酯的含量。綜合可知, 銅對脂肪的含量的影響可能與魚的種類以及水體中銅暴露濃度和時間有關。肝胰臟脂肪含量的變化通過組織學(HE染色)可以得到很好的證實, 同時肝體比也匹配上了肝胰臟脂肪含量的變化。本實驗結果表明, 暴露于高濃度銅環境后, 羅非魚肝體比顯著增加, 表明肝胰臟代謝明顯受到銅的影響, 這與單丹等[33]研究結果一致。Liu等[15]、Huang等[23]也報道稱, 不同濃度銅離子暴露15d和30d均會使矛尾復鰕虎魚肝體比顯著增加。Grosell等[47]指出, 通常情況下海水魚對水體銅離子的敏感度低于淡水魚,通過上述研究與本實驗的對比, 驗證了這一結果。已有研究表明, 肝臟新陳代謝與肝體比成正相關[48]。

3.3 水體中不同濃度銅離子暴露對羅非魚膽固醇代謝的影響

膽固醇是維持生命活動的重要保障, 而肝臟是膽固醇合成的主要場所[49]。HMG-CoA還原酶是膽固醇合成的主要限速酶, 且細胞內膽固醇的含量通過HMG-CoA還原酶實現負反饋調節[50]。已有研究表明, 用5 mg/L硝酸鉛水體暴露攀鱸30d后肝臟中膽固醇含量降低[26]。在本實驗中, 肝胰臟總膽固醇含量和HMG-CoA還原酶雖無顯著差異, 但卻存在一定變化趨勢。總膽固醇含量隨著環境銅離子濃度升高呈現增加的趨勢, 而HMG-CoA還原酶正好相反, 證實了膽固醇的負反饋調節機制。

魚類血液生化指標與其機體的代謝、營養狀態和疾病密切相關[51]。膽固醇是許多類固醇激素的前體, 在體內有著廣泛的生理作用, 但當其過量時便會導致脂質代謝和脂蛋白代謝紊亂, 對機體產生不利影響[52,53]。章龍珍等[54]研究發現, 中華鱘(Acipenser sinensis)在不同濃度的銅離子(0.40、0.89和2.00 μg/L)水體中暴露60d后, 血液中膽固醇含量隨銅離子濃度的增加而升高。本研究中暴露于0.4和0.8 mg/L銅離子的羅非魚血清總膽固醇含量顯著高于對照組, 說明水體銅離子對膽固醇代謝產生顯著影響, 與上述研究一致。低密度脂蛋白(LDL)是向組織轉運肝臟合成的內源性膽固醇的主要形式; 高密度脂蛋白(HDL)則與其相反, 它是膽固醇的“清掃機”, 負責把膽固醇運回肝臟代謝[55], 兩者在血液中分別以LDL-C和HDL-C結合膽固醇[56]。一般認為, HDL-C有預防動脈硬化效果, 而LDL-C易引起動脈硬化[57]。血清中總膽固醇是HDL-C和LDL-C二者綜合作用的結果[56], 本研究中HDL-C和LDL-C含量均有升高的趨勢, 且LDL-C含量產生顯著差異, 符合血清總膽固醇變化趨勢, 也進一步說明水體中銅離子可以誘導羅非魚血脂異常, 從而促進處理組羅非魚肝胰臟膽固醇向血液中轉運, 增加了膽固醇在外周血管中的蓄積。

3.4 水體中不同濃度銅離子暴露對羅非魚肝功能的影響

GPT和GOT是肝臟特異性酶, 能反映肝臟的組織病變[58]。脊椎動物在正常情況下, 組織細胞內的轉氨酶只有少數釋放到血漿中, 當組織病變細胞通透性增加時, 細胞內的轉氨酶就會大量釋放進入血漿[59]。王書鳳等[40]發現, 在環境重金屬鉛、鎘、銅和鋅的條件下羅非魚血漿GPT和GOT酶活力顯著提高。潘魯青等[60]研究表明在銅(0.1、0.2、0.5和1 mg/L)作用下, 96h凡納濱對蝦(Litopenaeus Vannamei)血液中GPT和GOT均有升高的趨勢, 且血液中2種轉氨酶活力的激活率為GPT

圖版Ⅰ 水體中不同濃度銅暴露后羅非魚肝胰臟HE染色切片PlateⅠ Hepatopancreas histology of tilapia exposed to different waterborne Cu concentrations1. 對照組; 2. 0.2 mg /L; 3. 0.4 mg/L; 4. 0.8 mg/L(×400, 下同)1. Control; 2. 0.2 mg/L Cu treatment; 3. 0.4 mg/L Cu treatment; 4. 0.8 mg/L Cu treatment (×400, the same applies below)

在正常情況下, 魚類肝臟組織中脂滴數量較少,然而在病理情況下, 魚類肝臟中脂滴會大量增多[42]。本實驗結果顯示, 在水體中銅離子暴露下羅非魚的肝胰臟均出現空泡化, 且隨著處理濃度的升高, 肝胰臟空泡化比例升高, 脂滴數量也隨之增加, 表明外界水體銅濃度過高導致羅非魚肝胰臟產生了病理損傷。黃超[45]研究表明經30d水體慢性銅(2、18、38和55 μg/L)暴露后, 蝦虎魚肝臟空泡比例隨著水體銅濃度增加而增大, 與本實驗結果一致, 且蝦虎魚是一種受刺激后易敏感的物種, 與羅非魚相比,在水體銅暴露下其機體更容易受到損傷。

3.5 水體中不同濃度銅離子暴露對羅非魚脾臟組織結構的影響

MMCs在魚類中通常位于脾和腎等造血組織中, 在一些魚類肝臟中也有發現[61]。MMCs的變化不僅可以作為魚體本身健康狀況的良好指標, 也可以作為水環境應激條件的敏感指標[61,62]。對新熱帶鯰(Rhamdia quelen)[63]的研究表明, 在11 μg/L銅離子暴露96h下, 肝臟中MMCs數量顯著增加, 與本實驗研究結果類似。本實驗結果顯示, 與對照組的脾臟相比, 處理組MMCs數量明顯增加, 可以認為是銅暴露后的標志性變化, 反映了組織遭到破壞的情況。

已有研究表明脂褐素沉積可在大量的不同病理情況下出現[64]。陳其晨等[65]發現, 長期生活在遭受污染的水環境中, 大齡的白鰱(Hypophthalmichthys molitrix)和草魚(Ctenopharyngodon idella)的肝、腎、脾等組織器官都發生了不同程度的病變。這些組織器官存在數量較多的巨噬細胞, 能吞噬大量的脂褐素, 形成脂褐素細胞團。在本實驗中,與對照組相比, 0.2、0.4和0.8 mg/L處理組脾臟出現了較多的脂褐素, 表明銅離子暴露后組織和細胞受損傷導致了脾臟MMCs的脂褐素增多。

綜上所述, 水體銅暴露顯著抑制了羅非魚的生長性能, 導致羅非魚脂代謝紊亂以及肝胰臟脂肪大量蓄積, 且對脾臟免疫及機體健康造成了一定的損傷。