大腸菌群主要檢測方法研究進展

韋巧革

（融水苗族自治縣疾病預防控制中心，廣西柳州，545300)

微生物學檢測結果是判斷食品是否符合質量要求與衛生學要求一項重要標準，食品微生物學檢測指標包含三項，即大腸菌群檢測、致病菌檢測、細菌總數檢測等[1]。目前國內外均以大腸菌群作為食品、水體污染常用指示菌，評價與判斷食品被糞便污染程度和有無腸道致病菌污染可能[2]。大腸菌群是一種處于37℃、24h 能發酵乳糖，產酸、產氣，需氧和兼性的革蘭陰性無芽孢桿菌統稱，該細菌多存在于溫血動物糞便便中，人、畜糞便對外界環境污染是大腸菌群在自然界主要原因，對此，大腸菌群被國際公認為檢測各種水質、食品、醫藥在流行病學上安全性指示菌[3]。若所檢測結果為陽性，則表示藥品、食品、水質中存在該菌群，并被糞便污染。研究表明[4]，大腸菌群數量和受到污染程度呈正比，數量越多，受污染越為嚴重。我國目前主要以多管發酵法檢測大腸菌群，其是一種傳統檢測方式，準確性、權威性無可置疑，但因費時費力和檢測費用高現無法滿足人們對藥品、食品等監測。對此，對于藥品、食品監督急需一種快速、有效的大腸菌群檢測方式[5-6]。近些年來，世界各地針對大腸菌群檢測具有專門研究，文章現結合大量研究綜述大腸菌群快速檢測技術的進展，對其應用前景展開分析。

1 傳統檢測方式改進技術

1.1 試劑盒法主要依據水質、國家食品標準檢測方式多管發酵方法研制而成。主要原理是將液體乳糖培養基經過固化加工后置于特制透明塑料盒中，組成試劑盒，該檢測方式具有操作簡單快速、結果判定清晰準確、成本低廉以及便于攜帶和保存等優勢。趙娣偉[7]研究中針對生活飲水中大腸菌群利用試劑盒法檢測，結果顯示，其靈敏度在100%，特異度是98.18%，正確指數為98.18%。可見是一種科學、實用、可靠的檢測方式，適于水質、食品大腸菌群的檢測。

1.2 快速測試片法該檢測原理是將適量乳糖、指示劑溴甲酚紫及革蘭氏陽性菌抑菌劑吸附在一定面積無菌濾紙上，大腸菌群生長發酵乳糖產酸使PH 值降低，溴甲酚紫指示劑從紫色轉變為黃色，在紙片上呈黃色反應，并且在菌體中含有脫氫酶還原TTC 形成紅色不容性紅四氮唑，從而有效顯示出紅色斑點，若能滿足以上兩種特性作為陽性結果判定標準[8]。樸相哲[9]研究中對比快速測試片法和GB 法檢測在生鮮豬肉中大腸菌群結果，結果表示前者更利于在生鮮豬肉中對大腸菌群計數的統計，且有效縮短了其檢測流程。

2 分子生物學技術

2.1 聚合酶鏈式反應法（PCR）PCR 以它的微量、重復性好、快捷等特點在醫學領域中得到廣泛使用。主要是利用耐熱DNA聚合酶作用，通過變性、延伸、復性循環操作在體外迅速將DNA模板擴增數百萬倍的一種克隆技術[10]。雖其存在較高敏感性和特異性，但因食物組分中存在多種酶抑制劑，從而影響到PCR法檢出率，且PCR 法無法區分活菌和死菌，故較難對大腸菌群定量分析。

2.2 基因芯片技術基因芯片技術是近些年出現的一種新型技術，具有較強交叉性，為目前當今研究熱點，是將已經設計的基因片段或寡核肝酸依據一定循序緊密排列在芯片上，熒光標記分子經PCR 擴增方式進入到微生物樣品DNA，且和芯片上寡核苷酸點雜交，最后經熒光波長掃描儀利用計算機軟件分析得到樣品含量。祝儒剛[11]學者使用基因芯片技術對大腸埃希氏菌進行檢測，靈敏度達2pg，并表示所制備的基因芯片檢測實際肉及肉制品樣品準確率高于傳統培養法，能夠作為食源性致病菌檢測理想手段。賀晨[12]將該技術和PCR 技術聯合應用，多種PCR 擴增，制備芯片，將擴增產物和含有探針基因芯片雜交，結果表明其對大腸桿菌特異性檢測靈敏度達2x10-3ng。因該技術存在靈敏度高、快捷、操作方便等特點逐漸成為熱門研究領域。

1.3 原位雜交法（ISH）主要原理是人工合成大腸菌群DNA 或RNA 序列互補的探針，隨后和大腸菌群行原位雜交，進而檢出相對應大腸菌群，該方式目前用于含大腸菌群濃度低的飲用水檢驗，最多用熒光標記探針來進行熒光原位雜交。有關研究表示[13]，原位雜交技術具備簡便、操作快速、安全、穩定等優勢，且可進行定量分析，但其操作步驟繁瑣，技術繁雜從而難以規模化推廣。王建龍[14]研究中通過熒光標記探針取代同位素探針熒光原位雜交技術（FISH），并表示FISH 技術可以用于飲用水中大腸菌群的檢測，且在較短時間內（6～8h）給出定量分析。

3 免疫學技術

3.1 酶聯免疫吸附法(ELIsA)酶聯免疫吸附法是1971年ENCVEIL 等建立在免疫酶基礎上的一種新型免疫測定技術，是目前較為常用的一種檢測手段。并有研究表示[15]其具有快速、簡便等優點，但抗原和抗體濃度與反應液以及抗體特異性可產生影響。若污染物較嚴重且進行檢測，ELISA 法存在嚴重缺陷，因其受到其他存在細菌影響而降低方法特異性。主要原理是利用酶標記抗體或酶標記抗原進行抗原抗體反應，酶和底物產生深淺不一顏色反應[16]。測定時酶標記在抗體分子上形成酶標抗體，在大腸菌群和酶標反應形成復合物之后，底物被酶催化，進而生成有色產物，其中，產物的量和樣本待檢驗質的含量存在直接關系，故依據呈色深淺進行定量分析，其適于所有食品大腸菌群的檢測[17]。

3.2 免疫磁珠技術（IMB）免疫磁珠技術以磁珠作為抗體載體，通過抗體抗原結合磁力作用下發生力學移動，進而達到分離特異性抗原目的。國外一學者使用改法從患者糞便中分離出多注山梨醇陽性O157:H7 大腸桿菌，表示該方式敏感度高，特異性好，且操作復雜，但不具備廣泛使用能力。

4 小結

以往針對大腸菌群檢測方式實驗量大，步驟雜，且費時費力，以及靈敏度差等缺點，而近些年發展的大腸菌群快速檢測方式包含PCR 法、酶聯免疫吸附法等，有效解決了上述問題，但檢測特異性、敏感性及操作上存在多種問題，故還未有一種真正達到成本低、靈敏度好、準確性高等檢測方式，故仍需不斷科學研究，尋找一種適宜的方式。