富含半胱氨酸蛋白61對子宮內膜癌細胞增殖及細胞周期的影響及其機制研究*

李大眾，黃敏敏，劉慧玲

（連云港市第二人民醫院 婦科，江蘇 連云港 222006）

子宮內膜癌（endometrial carcinoma, EC）是女性生殖道高發惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的7%左右，且發病率呈上升趨勢[1]。目前EC 以手術治療為主，輔助內分泌治療、放化療，遠期預后較好，但仍是導致女性死亡的主要疾病之一，亟待更為有效的干預方式。近年來，國內外學者對EC發病機制進行了深入研究，旨在尋找其特異基因，為EC 的基因治療提供靶點[2-3]。富含半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich 61, CYR61）是 CNN 家族重要成員，促有絲分裂活性、趨化性作用顯著，在腫瘤中表現為多樣化的生物學功能。CHEN 等[4]研究發現，CYR61 在黑色素瘤中異常高表達，且上調CYR61將進一步促進腫瘤轉移。然而，目前關于CYR61在EC 中的表達水平及作用尚不明確。本研究通過體外實驗，觀察CYR61 對EC 細胞株HEC-1B 增殖及細胞周期的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人正常子宮內膜腺上皮細胞由上海博湖生物科技有限公司提供并進行質量控制，EC 細胞株HEC-1B 購自上海酶研生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 CYR61 過表達質粒pcDNA3.1 CYR61 及陰性對照質粒pcDNA3.1-NC（上海海吉浩格生物科技有限公司），β-catenin 通路激活劑LiCl（上海莼試生物技術有限公司），MTT Assay 試劑盒（美國Abcam 公司），兔抗人CYR61、β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1 一抗（美國R&D 公司）。

1.1.3 主要儀器 DYCZ-24 電泳儀（北京六一生物科技有限公司），GelDoc XR+全自動凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司），Stat Fax-4200 酶標儀（美國Awareness 公司），EPICS XL 流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人正常子宮內膜腺上皮細胞、HEC-1B 細胞株培養于F12/DMEM 培養基中，含10%胎牛血清，鏈霉素0.1 g/L，青霉素105IU/L，置于標準環境（5% CO2、37℃、飽和濕度）中培養[5]。細胞貼壁約80%時，經0.25%胰蛋白酶（含0.01% EDTA）消化、傳代，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2 細胞分組及干預 取對數生長期HEC-1B 細胞，按1×105個/mL 的密度接種至6孔板，每孔2 mL，培養過夜。將細胞隨機分為Control 組、pcDNA3.1-NC 組、pcDNA3.1 CYR61 組、pcDNA3.1 CYR61+LiCl組。 Control 組不處理， pcDNA3.1-NC 組依據LipofectamineTM3000 脂質體轉染說明書轉染陰性對照 質 粒 pcDNA3.1-NC，pcDNA3.1 CYR61 組 轉 染CYR61 過 表 達 質 粒 pcDNA3.1 CYR61，pcDNA3.1 CYR61+LiCl 組轉染 pcDNA3.1 CYR61，并加入 LiCl 使其終濃度為60 mmol/L[7-8]。每組設置5 個復孔。培養48 h 用于后續實驗。

1.2.3 Western blotting 檢 測 CYR61、β -catenin、Caspase-3、Cyclin D1 蛋白的表達 取對數生長期人正常子宮內膜腺上皮細胞、HEC-1B 細胞株，加入預冷RIPA 細胞裂解液，轉移至離心管，10 000 r/min離心15 min，BCA 法測定蛋白含量。取50 μg 待測蛋白，與上樣緩沖液充分混合，金屬浴煮沸5 min，離心取上清液，上樣電泳后濕轉至膜，封閉液室溫搖床封閉2 h，TBST 清洗，加入兔抗人CYR61 一抗（1∶800），4℃搖床孵育過夜，TBST 清洗，加入山羊抗兔 I gG 二抗（1∶2 000），室溫孵育 2 h，TBST 清洗[6]。加入ECL 發光液顯色，暗室曝光，經全自動凝膠成像系統分析，以目的蛋白/內參GAPDH 灰度值表示蛋白相對表達量。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖抑制率 取各組細胞，PBS 充分洗滌后用0.25%胰蛋白酶消化，重懸后調整密度至1×105/mL，接種至96 孔板，24 h、48 h、72 h后每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），2 h 后棄上清液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，振蕩10 min 至甲瓚結晶完全溶解，采用酶標儀檢測各組490 nm波長處吸光度（Absorbance, A）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1-干預組A 值/Control組 A 值）×100%[9]。

1.2.5 PI 染色法檢測細胞周期占比 取各組細胞，細胞生長至鋪滿底部＞80%時用0.25%胰蛋白酶消化，輕吹細胞，移至15 mL離心管，4℃、3 500 r/min離心5 min；PBS 沖洗，繼續離心 5 min；PBS 100 μL 重懸，加入70%預冷乙醇1 mL，混合均勻；4℃固定12 h，離心后 P BS 沖洗；加入染液（PI 染液 2 5 μL，RNaseA 10 μL，染色緩沖液 0 .5 mL），避光冰浴30 min；采用300 目細胞濾網過濾，在60 min 之內采用流式細胞儀檢測細胞周期。所有操作重復3 次，取平均值[10]。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 26.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人正常子宮內膜腺上皮細胞、HEC-1B 細胞CYR61蛋白相對表達量比較

人正常子宮內膜腺上皮細胞、HEC-1B 細胞CYR61 蛋白相對表達量分別為（1.25±0.27）和（0.41±0.06），經t檢驗，差異有統計學意義（t=6.971，P=0.000），與人正常子宮內膜腺上皮細胞比較，HEC-1B細胞CYR61蛋白相對表達量降低。見圖1。

圖1 兩種細胞CYR61蛋白的表達

2.2 各組細胞CYR61蛋白相對表達量比較

轉 染 48 h 后 ，Control 組 、pcDNA3.1-NC 組 、pcDNA3.1 CYR61組、pcDNA3.1 CYR61+LiCl組CYR61蛋白相對表達量分別為（0.40±0.06）、（0.39±0.05）、（1.01±0.14）、（0.57±0.07），經方差分析，差異有統計學意義（F=55.093，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與 Control 組、pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1 CYR61 組CYR61 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與pcDNA3.1 CYR61 組比較，pcDNA3.1 CYR61+ LiCl 組CYR61 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；Control 組與pcDNA3.1-NC 組CYR61 蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞CYR61蛋白的表達

2.3 各組細胞增殖抑制率比較

pcDNA3.1-NC組、pcDNA3.1 CYR61組、pcDNA3.1 CYR61+ LiCl 組 24 h、48 h、72 h 增殖抑制率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點增殖抑制率有差異（F=25.416，P=0.000）；②3 組增殖抑制率有差異（F=46.962，P=0.000），pcDNA3.1 CYR61 組增殖抑制率較高，增殖抑制效果好；③3 組增殖抑制率變化趨勢有差異（F=37.541，P=0.000）。見表1。

表1 各組增殖抑制率比較 （%，）

表1 各組增殖抑制率比較 （%，）

注 ：? 與pcDNA3.1 CYR61組比較，P ＜0.05。

組別pcDNA3.1-NC組pcDNA3.1 CYR61組pcDNA3.1 CYR61+LiCl組72 h 0.49±0.08?51.57±6.92 36.69±7.30?24 h 0.47±0.05?25.98±4.37 12.36±3.91?48 h 0.45±0.07?37.49±6.92 24.47±4.29?

2.4 各組細胞周期占比比較

Control 組、pcDNA3.1-NC 組、pcDNA3.1 CYR61組、pcDNA3.1 CYR61 + LiCl 組 G0/G1、S、G2/M 期占比比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與Control 組、pcDNA3.1-NC 組 比 較 ， pcDNA3.1 CYR61 組 G0/G1期占比升高（P＜0.05），S、G2/M 期占比降低 （P＜0.05）； 與 pcDNA3.1 CYR61 組 比 較 ， pcDNA3.1 CYR61 + LiCl 組 G0/G1期占比降低 （P＜0.05），S、G2/M 期 占 比 升 高 （P＜0.05）； Control 組 與pcDNA3.1-NC 組 G0/G1、S、G2/M 期占比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組細胞周期占比比較 （%，）

表2 各組細胞周期占比比較 （%，）

注 ：①與Control組、pcDNA3.1-NC組比較，P ＜0.05；②與pcDNA3.1 CYR61組比較，P ＜0.05。

組別Control組pcDNA3.1-NC組pcDNA3.1CYR61組pcDNA3.1 CYR61+LiCl組F 值P 值G2/M 51.74±4.71 51.18±4.62 33.63±2.74①42.38±3.02①②911.341 0.000 G0/G1 23.12±5.23 23.29±6.01 56.26±7.24①39.87±5.71①②33.777 0.000 S 25.14±3.74 25.53±3.65 10.11±2.03①17.75±3.14①②274.651 0.000

2.5 各組細胞β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1蛋白相對表達量比較

Control 組、pcDNA3.1-NC 組、pcDNA3.1 CYR61組、pcDNA3.1 CYR61 + LiCl 組 β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與Control 組、pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1 CYR61 組 β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與pcDNA3.1 CYR61 組比較，pcDNA3.1 CYR61 + LiCl 組 β -catenin、 Caspase-3、Cyclin D1 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；Control 組與pcDNA3.1-NC 組β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3 和表 3。

圖3 各組細胞β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1蛋白的表達

表3 各組細胞β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1蛋白相對表達量比較 （）

表3 各組細胞β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1蛋白相對表達量比較 （）

注 ：①與 Control 組、pcDNA3.1-NC 組比較，P ＜0.05；②與pcDNA3.1 CYR61組比較，P ＜0.05。

Cyclin D1 0.96±0.08 0.97±0.09 0.21±0.03①0.32±0.04①②790.105 0.000組別Control組pcDNA3.1-NC組pcDNA3.1 CYR61組pcDNA3.1 CYR61+LiCl組F 值P 值β-catenin 0.27±0.03 0.26±0.04 0.08±0.01①0.15±0.03①②322.667 0.000 Caspase-3 0.98±0.07 0.99±0.08 0.12±0.02①0.51±0.06①②965.142 0.000

3 討論

EC 是一組起源自子宮內膜的上皮性惡性腫瘤，有研究認為內源性或外源性雌激素異常、糖尿病、肥胖及不良生活習慣均是其發生的危險因素[11]。目前關于EC 發病機制的觀點較多，大多認為與基因、信號通路活性異常引發細胞失控性增殖、微衛星多態性增加、p53 突變等有關[12]。因EC 早期癥狀較為明顯，確診較早，多數患者可采用手術切除治療，但其創傷較大，且術后面臨著較高復發、轉移風險。隨著基因治療技術的不斷進步，尋找有效的腫瘤標志物并針對性干預為進一步改善EC 預后提供了新的希望[13]。

CYR61是由生長因子誘導的立早基因，同時是關鍵的細胞基質調控因子，參與組織重塑、切口愈合及炎癥反應的發生、發展[14]。此外，CYR61也是腫瘤調控基因，與細胞增殖、侵襲、黏附，以及血管形成密切相關，但在不同腫瘤中的作用存在較大差異，例如在神經膠質瘤、乳腺癌等中發揮促癌作用，但在EC 中起到抑癌作用。有學者在研究CYR61 對EC 的診斷價值時發現[15]，其在子宮內膜組織中的表達明顯偏低，且在EC 細胞增殖中發揮負調控作用。本研究結果顯示，與pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1 CYR61 組增殖抑制率升高，G0/G1期占比升高，S、G2/M 期占比降低，提示上調CYR61 可抑制細胞增殖，并將其阻滯在G0/G1期。

Wnt/β-catenin 信號通路是引發腫瘤的重要通路之一，包含β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1 等多個部分，其中β-catenin 是該通路的關鍵因子，在生物信號自細胞膜轉移至胞漿、細胞核的過程中發揮重要作用。當該通路被激活時，酪蛋白酶與糖原合成激酶失活，無法降解β-catenin，使其活化并大量積累于細胞質中，從而激活下游靶基因Caspase-3、Cyclin D1，促進細胞增殖并抑制其凋亡。KASOHA 等[16]研究發現，在EC 中存在雌激素信號傳導系統與Wnt/β-catenin 信號通路失調，且兩種途徑中某些成分之間相互作用，從而表現出疾病特征，提示該通路參與EC 進程。本研究結果中 ， pcDNA3.1 CYR61 組 β -catenin、 Caspase-3、Cyclin D1 蛋白相對表達量低于Control 組、pcDNA3.1-NC 組 ， pcDNA3.1 CYR61+LiCl 組 上 述 指標高于pcDNA3.1 CYR61 組，且在轉染pcDNA3.1 CYR61 的基礎上聯用Wnt/β-catenin 信號通路的激活劑LiCl 可以減弱細胞增殖的抑制作用、細胞周期的阻滯作用，提示Wnt/β-catenin 信號通路在EC 中被激活，上調CYR61 可能通過抑制該通路，抑制EC 細胞增殖，并阻滯其細胞周期，從而發揮抗癌作用。CYR61基因及Wnt/β-catenin 信號通路可能成為治療EC 的新靶點。