神經-骨偶聯機制促異位骨化進展的研究進展*

張滋彬，萬千千，覃文聘，盧偉誠，韓瀟瀟 綜述,焦 凱△ 審校

(軍事口腔醫學國家重點實驗室/國家口腔疾病臨床醫學研究中心/陜西省口腔疾病臨床醫學研究中心/第四軍醫大學口腔醫院：1.黏膜病科；2.修復科，西安 710032)

異位骨化(heterotopic ossification，HO)是一種在肌肉或其他非骨骼組織中出現鈣鹽沉積進而形成異常骨成分的疾病，其發生過程復雜，主要包括成骨干祖細胞被募集到骨外組織、暴露于成骨誘導環境中，進而經歷軟骨內成骨等階段，最終形成與正常骨組織相同的骨骼組織[1]。HO是常見的創傷和外科手術后并發癥[2]。目前臨床上主要運用非甾體抗炎藥和激光照射來預防HO的發生，治療HO則主要通過手術切除的方式[3]，但是手術效果并不是很理想，且術中也存在很多亟待解決的問題，如當異位的骨組織卡住神經和血管時，操作有較大的難度和風險。此外，術后問題如復發、感染及圍手術期骨折等成為臨床難題，造上述問題的主要原因還是對HO的發病機制認識不清楚。

關于獲得性HO的首次報道揭示了一個現象，即戰爭中的戰士，尤其是脊髓受傷或受槍傷者會更頻繁地發生該疾病。分析原因發現，軍事戰創傷常常為爆炸傷或燒傷，對神經系統產生巨大影響，而軍事戰創傷的患者中HO的發生率很高，這提示神經刺激與HO的高發生率可能相關[4-5]。近期也有大量研究證明了HO與神經密切相關[6]。因此，本文將圍繞神經-骨偶聯機制促進HO進展的近期前沿研究成果作一綜述。

1 外周神經提供了HO的細胞來源

外周神經在調控HO中發揮著重要作用。DAVIS等[7]證明了骨基質釋放骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)可以誘導HO產生，但是單獨由BMP誘導產生HO必須有足夠多量的BMP參與，所以推測還有其他因素參與，才使得HO發生。該研究還發現，引發HO的危險因素可以歸納出一個共同特點，即周圍神經損傷，并提出外周神經損傷和BMP同為促進HO的重要因素這一觀點。此外，近期大量研究發現BMP-2可以通過激活瞬時感受器電位V亞家族陽離子通道1(transient receptor potential cation channel V 1，TRPV1)受體來誘發神經源性炎癥，此過程會誘導神經釋放大量降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)和P物質(substance P，SP)并促進肥大細胞釋放基質金屬蛋白酶(matrix metallopeptidase，MMP)-9，而MMP-9可以改變細胞通透性進而開放血管神經屏障(blood-nerve barrier，BNB)。研究發現，只有在BNB開放和BMP同時存在的條件下，神經內膜中的骨祖細胞才會被激活，進而誘導發生神經源性異位骨化(neurogenic heterotopic ossification，NHO)。這些研究都表明神經為HO提供了細胞來源并促進其發生。LAZARD等[8]證明了感覺神經內膜中的骨祖細胞是HO的細胞來源，并闡明了骨祖細胞遷移的機制。該研究應用BMP-2構建了HO的小鼠模型，通過免疫組織化學和熒光分選等方法研究發現，神經內膜中的骨祖細胞會在誘導HO后48 h內穿過BNB離開神經內膜，進入血液循環并隨之遷移，最終在HO位點處離開血管，進入新骨形成的地方，激活HO的發生、發展。相比未誘導形成HO的對照組小鼠中的細胞，實驗組的骨祖細胞會表達更多緊密連接蛋白claudin 5和成骨細胞特異性轉錄因子osterix，同時還表達神經生長因子受體和神經標志物等分子，結果證明了神經內膜來源的骨祖細胞是HO的主要細胞來源。此外，ACLOQUE等[9]提出在胚胎發展中，神經脊細胞會遷移并轉變為多種功能的間質細胞(即上皮間質轉化)，其中就包括了參與成骨進而形成骨組織和軟骨組織這一生理過程，這也是神經為HO提供細胞來源的證據之一。

2 神經系統與免疫系統的相互作用參與HO的發生與發展

神經源性炎癥在HO的發生中發揮了重要作用。有研究顯示，60%的患者在使用吲哚乙酸及其他非甾體抗炎藥后，會產生很理想的預防HO發生的作用[10-11]。SP和CGRP是神經源性炎癥中的重要分子，并對骨的代謝活動也發揮著重要的調控作用，如CGRP可以通過上調環腺苷酸(cAMP)水平激活成骨樣細胞中的BMPs信號通路進而誘導成骨分化活動。TUZMEN等[10]將神經肽SP和CGRP注射到小鼠跟腱中構建HO模型，通過免疫標記和組織學分析等方法檢測SP和BMPs等指標，實驗發現單獨應用SP時，會誘導產生HO且伴隨著內源性BMPs水平上調；而單獨應用CGRP或同時應用SP和CGRP時，雖然BMPs水平上升，但是沒有產生炎癥或HO。這些現象提示了SP和CGRP在HO中可能存在拮抗作用。上述研究結果證明了SP可以通過增加血管和膠原增生等退行性變化，以及增加BMPs分泌來促進HO的形成，而CGRP可以抵消SP的促進形成作用進而阻斷SP誘導形成HO的現象?？偠灾鲜鲅芯勘砻?，感覺神經可以通過分泌SP和CGRP來調控炎癥和BMP信號通路，從而調控HO的發生、發展。

此外，HO中的神經源性炎癥與肥大細胞和單核細胞等免疫系統細胞有著密切的聯系。其中，巨噬細胞及肥大細胞對炎癥的發生和骨代謝活動有重要的作用。感覺神經分泌的SP和CGRP可以激活初級肥大細胞并增加肥大細胞的脫顆?；顒樱蚀蠹毎置诘幕钚越橘|可以進一步激活感覺神經釋放SP和CGRP，從而產生對神經源性炎癥的正反饋調節，參與調控HO的發生、發展過程。SALISBURY等[12]研究證明，使用肥大細胞穩定劑來減少表達SP受體和神經激肽-1受體的肥大細胞，可以顯著地減少HO的發生，表明肥大細胞及其相關活性因子對HO有顯著的調控作用。CONVENTE等[13]利用活化素A受體1R206H(activin A receptor type Ⅰ R206H，Acvr1R206H)突變小鼠模型研究了骨纖維發育不良(fibrodysplasia ossificans progressiva，FOP)疾病中由于受傷產生的炎性細胞和分子反應，結果發現 Acvr1R206H突變FOP小鼠受傷后，BMP水平會有所上升，并伴隨著由于免疫細胞長期滲入而增加的異常骨骼肌肉修復行為，表明損傷后Acvr1cR206H/+ 損傷部位和Acvr1cR206H/+肥大細胞會被激活并產生腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β及IL-6等活性因子來參與炎性反應，進而促進HO。同時，該研究通過單獨去除肥大細胞或巨噬細胞，以及同時去除肥大細胞和巨噬細胞3種情況發現，損傷誘導的HO體積均有所減少，且去除巨噬細胞的效果更為明顯。這些實驗結果表明，免疫系統中的肥大細胞和巨噬細胞參與啟動并發展了FOP中的HO。HACKETT等[14]研究發現，肌腱鈣化時伴隨著傷口處炎性巨噬細胞和肥大細胞侵襲滲入，血管和神經均發生顯著的生長活動；同時GENT等[15]研究證明，通過化學和基因的方法去除巨噬細胞，可明顯減少HO的形成。以上研究均表明HO離不開神經源性炎癥中的免疫細胞和免疫系統的調控作用。

3 HO發生所必需的棕色脂肪組織的產生受交感神經調控

棕色脂肪組織被認為是產生能量的主要來源之一，任何生命活動都離不開能量的支持，同樣地，HO也需要棕色脂肪組織提供一定的能量來維持活動[16]。SALISBURY等[17]通過研究HO小鼠模型發現，瞬態棕色脂肪組織(transient brown adipose tissue，tBAT)與缺氧微環境和軟骨沉淀的發生密切相關。tBAT一側緊鄰缺氧的軟骨組織，另一側存在常氧的血管形成活動，而且tBAT會產生促血管形成因子來加速血管形成。因此，tBAT不僅為HO的形成提供能量，還可以通過促進血管生成和軟骨沉淀參與到HO的發生、發展過程。同時，小鼠發生HO時，皮下脂肪組織會產生持久的高腎上腺素能的環境，可與交感神經系統的β3腎上腺素受體結合，促進棕色脂肪組織表達解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)。此外，該研究還證明了其他刺激因素(如低體溫)，可以激活下丘腦腹內側核(ventromedial hypothalamic nucleus，VMN)促進交感神經釋放神經遞質去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)，而NE可以促進棕色脂肪組織上的β3腎上腺素受體的表達及棕色脂肪組織增殖，從而調控快速產熱過程并增加促HO發展的相關物質產生。

4 骨組織對HO中的周圍神經發揮調控作用

HO的疾病過程中骨基質會釋放BMPs改變神經的通透性，使得周圍神經的BNB開放，進而促進神經來源的成骨祖細胞離開神經、遷移到骨化的位點，從而發揮了骨對于HO中神經的調控作用[7]。近期研究發現，周圍神經內膜中的細胞可以接受BMP/Smad信號通路，這表明骨組織來源的BMP也許可以通過激活神經上的受體來發揮調控神經的功能。KOKUBU等[18]通過壓碎小鼠坐骨神經使軸突降解構建了周圍神經破壞的動物模型，通過分析BMP-7、BMP受體、p-Smad1/5/8、頭蛋白(Noggin)及內源性BMP的拮抗劑等變化，發現神經損傷在8周后得到恢復；軸突-神經膜細胞單元中BMP-7/Smad蛋白及mRNA表達水平在受傷后1周明顯提升并持續4周；Noggin的表達在2周后明顯上升；此外，該研究還利用雙重免疫熒光染色技術觀察到，在軸突再生的過程中BMP-7及p75NTR(NGFR)的共定位表達現象。體外實驗中還發現，BMP-7的應用可以誘導神經膜細胞顯著增生并提高其體外生存率；甲狀旁腺激素[(parathyroid hormone，PTH)(1-34)]的應用可上調神經膜細胞BMP-7水平。由此證明，周圍神經受傷后，去分化的神經膜細胞內BMP/Smad信號通路分子水平上調，并可調控神經再生。因此，研究者認為可以運用PTH(1-34)來上調神經膜細胞中內源性BMP-7水平以促進神經修復。另有研究表明，BMP-2水平及神經內膜中可以接受BMP/Smad信號的細胞數量，與HO的發病范圍密切相關[18]。SHI等[19]利用132只雄性SD大鼠構建了腦損傷模型，并分別檢測了術后1～7 d實驗組和空白對照組大鼠體內的MMP-9、MMP-2及金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)及其mRNA表達水平。結果發現，相較于空白對照組，實驗組大鼠血清MMP-9及其mRNA水平，以及TIMP-1 mRNA表達水平均明顯升高。表明MMP-9水平病理性升高，以及MMP-9與TIMP-1之間的動態平衡改變均可以促進細胞外基質的降解、重建及鈣化過程，并且誘導HO中成骨祖細胞的產生。因此，MMP-9可視為一種HO的預測標志物；并且，HO中周圍神經和骨組織之間存在偶聯通路，有望成為HO治療的新靶點。

5 骨化性肌炎的發生與發展受神經調控

骨化性肌炎是由纖維組織在軟組織中自限性地增生，并化生為成熟的板層骨的肌纖維母細胞瘤，也是一種良性形式的HO，通常發生在強壯的運動員大腿股四頭肌和內收肌[20-21]。臨床上將骨化性肌炎分為外傷性骨化性肌炎(myositis ossificans traumatica，MOT)與進行性骨化性肌炎(myositis ossificans progressiva，MOP)兩種[22]，以MOT最為常見。目前臨床上尚無治療骨化性肌炎的有效手段，這與其發病機制尚不明確密切相關。骨化性肌炎的形成過程包括了初始的增生階段、中期的鈣化和成骨階段及晚期的完全骨化階段，這些過程涉及多種因素參與，而神經的調控便是其重要環節；同時，骨化性肌炎對于軟組織如神經的影響也是廣泛的[23]。神經源性骨化性肌炎起源于外周神經或中樞神經的損傷，疾病可能會導致關節強直及血管神經的壓迫現象[24]。GUAN等[25]發現，骨化性肌炎是創傷后比較常見的并發癥之一，并且在發生骨化性肌炎的患者中發現高達53%為脊髓神經受傷者。LAW-YE等[24]調查發現，神經源性骨化性肌炎患者中11%～22%是腦損傷患者，15%～20%是脊髓損傷患者；研究者還通過1例多系統受傷的43歲摩托車手患者發現，實行神經減壓術可以延緩骨化性肌炎的發生、發展。同時，如果對神經的損傷狀態進行早期診斷、早期干預，可以阻止患者骨化性肌炎的發生，這提示神經在骨化性肌炎中發揮著重要作用[25]。

6 小 結

神經可以通過提供細胞來源、與免疫系統交聯及調控棕色脂肪組織產生等方式調控骨組織中HO的形成及礦化等活動，而骨組織也可以在此過程中對神經活動進行調控，二者之間的相互作用對HO的發生、發展有著重要作用。闡明HO發生、發展過程中的神經-骨偶聯機制，可為其臨床防治提供新的靶點。然而，目前許多研究尚不成熟，還有待大量研究進一步探索。