夏輝 鄭揚 宋媛媛

盡管世界衛生組織(World Health Organization，WHO)推薦并廣泛應用的分子生物學耐藥檢測技術如GeneXpert MTB/RIF、線性探針檢測等解決了結核分枝桿菌(MTB)對利福平(RFP)、異煙肼(INH)及氟喹諾酮類藥物耐藥性的快速檢測問題[1]，但畢竟檢測藥物種類有限。基因組測序技術可以同時預測MTB對多種藥物的耐藥，彌補了商品化分子生物學檢測技術的不足，但是在尋找和解釋MTB新型突變時若沒有可靠的表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結果，則仍存在挑戰[2]。目前應用的傳統表型藥敏試驗方法是一支培養基對應一種藥品的一個濃度，且大多數藥物僅基于一個臨界濃度(critical concentration)進行敏感或耐藥的定性分類。臨界濃度是一個較低的濃度，但對于某些藥物如莫西沙星(Mfx)，建議在更高的臨床折點濃度(clinical breakpoint)下進一步檢測其耐藥性。這里所說臨界濃度指體外實驗抗結核藥物能抑制99%的表型野生型菌(phenotypically wild type，pWT)生長時的最低濃度。而臨床折點濃度則是一個高于臨界濃度的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，使用該濃度將可能對治療有反應的菌株與可能對治療無反應的菌株區分開來。即在體外低濃度檢測耐藥但高濃度下仍敏感時意味著患者使用更高的藥物劑量可以克服在較低劑量下觀察到的耐藥，該濃度的確定需要依據臨床治療結果、MIC分布和藥代動力學/藥效學數據(包括藥物劑量)等綜合確定。MIC指在固體培養基或液體肉湯培養基藥敏試驗中，能阻止99%以上微生物生長的抗菌劑的最低濃度。還有一個重要的概念是流行病學臨界值(epidemiological cut-off value，ECOFF)。ECOFF在以前結核病實驗室診斷領域未被引入，但是在其他病原菌的藥敏試驗中是非常重要的概念。現階段結核病診斷領域的臨界濃度即對應于ECOFF[3]。通常，當使用標準化方法測試MIC時，針對pWT會形成單個高斯分布形態，即pWT分布；ECOFF對應于pWT分布的右端(即通常包含99%的pWT菌株)。

肉湯微孔板法結核分枝桿菌復合群藥敏試驗一般使用96孔微孔板(單孔底面積約0.32 cm2，加液量不超過200 μl)，根據藥物在微孔板上的排列方式和每種藥物包含的濃度范圍，每塊微孔板可以同時檢測多種藥物，相比以往的基于單支培養基的固體和液體表型藥敏試驗可以減輕工作量，同時減少孵育空間需求。并且，微孔板法可以得到每株具體的MIC值，區別于單純的二分類敏感/耐藥定性結果。下面將重點針對微孔板法藥敏試驗的優勢及優化方法進行解讀。

一、肉湯微孔板法結核分枝桿菌復合群藥敏試驗介紹及優化思路

(一)方法優勢

1.識別不同水平耐藥：目前抗結核治療方案的選擇依據藥物藥敏試驗結果(耐藥和敏感)，尤其是某些核心藥物如RFP和氟喹諾酮類藥物藥敏試驗結果。因為對于大多數藥物而言，傳統表型藥敏試驗僅檢測基于臨界濃度的結果(Mfx除外)，無法獲知耐藥水平對療效的影響。盡管已知某些突變導致的MTB耐藥為低水平耐藥，但多數情況下基因型藥敏試驗也僅報告敏感或耐藥二分類結果，臨床也僅依據該結果制定相應的治療方案。盡管WHO已更新了線性探針技術的結果解讀和報告，但在臨床系統并未進行更新[4]。而微孔板法可以包含數量不等的高于臨界濃度的多個濃度，可以區分低水平和高水平耐藥，進一步告知臨床醫師是使用標準的藥物劑量還是需要提高藥物劑量來治療感染MIC輕微升高MTB菌株的患者。同時，通過積累數據還可以為其他藥敏試驗方法是否需要設置高于ECOFF的折點(即臨床折點)提供更多的證據。而這些都是以往基于耐藥/敏感的二分類結果的表型藥敏試驗無法獲得的。

2.解釋并發現某些不穩定結果及不一致結果：多數情況下耐藥MTB菌株的MIC值升高較明顯，但對于部分抗結核藥物因某些耐藥機制(如某些rpoB臨界突變引起的RFP耐藥)導致的耐藥MTB的MIC僅輕微升高[5]，致其MIC分布與敏感菌株的MIC分布重疊較多，意味著選定的臨界濃度與這些耐藥機制引起的耐藥菌株MIC分布會發生交叉。對此類菌株如果僅依據單一的臨界濃度檢測耐藥與敏感二分類結果，重復性必然會差。減少這種將耐藥誤分類為敏感的最佳方法是通過減少MIC檢測技術不確定性來消除或最小化MIC分布之間的重疊程度。因ECOFF或臨界濃度的設置是抑制99%的pWT菌株，所以理論上當耐藥菌株在全部菌株中占比接近1%時，現有表型藥敏試驗方法的陽性預測值會很差，因為這1%的敏感菌株會由于不可避免的技術層面的不確定性被錯誤分類為耐藥。某種程度上，可以獲得具體MIC值的微孔板法將能夠識別這種隨機的錯誤導致的耐藥結果，即當MIC值升高僅高于ECOFF一個濃度時出現此類錯誤的概率會較大，而對于MIC值高于ECOFF兩個濃度的菌株，則不太可能發生此類錯誤。對于某些基因型和表型藥敏試驗不一致結果，也可以通過具體的MIC值解釋。

(二)方法設計需考慮的問題

1.現行使用的微孔板法存在的問題：技術專家小組對現有的商品化微孔板或定制微孔板的現狀尤其是存在的問題進行了匯總。全球應用最多的是自2010年開始商業化的稱為SensititreTMMYCOTB或SensititreTMMYCOTBI的微孔板(簡稱“MYCOTB”)。該商品在我國也已經獲得批準使用。除了MYCOTB微孔板外，還分析了另外5種主要用于科研用途的由美國ThermoFisher公司提供的定制板，包含需要冷凍儲存及干燥形式的兩類微孔板，藥品涵蓋12～14種。歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)則推薦了非商品化微孔板法的標準參考方法。

MYCOTB在96孔微孔板中固定12種凍干的一線和二線抗結核藥物，但不包含A組和B組中的重要藥物，因此，無法界定更新的準廣泛或廣泛耐藥結核病。此外，也沒有明確界定臨界濃度，從而無法給出敏感或耐藥分類結果。某些藥品的濃度范圍設置也不合理，無法確保使用質控菌株H37Rv獲得可靠的質控結果，且MYCOTB說明書中的質控濃度范圍與美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的標準也不相同[6]。

除了藥物及濃度外，藥粉在幾種微孔板的存在形式(干燥或冷凍)、培養基的成分、接種菌懸液的配制流程及濃度、是否使用CO2孵育也不完全相同。

2.藥品數量設置需要考慮的問題：基于藥物濃度范圍的需求、各組藥物重要性、同類藥物中共同耐藥機制及交叉耐藥的情況，文件提出了優化的同一微孔板的藥品數量上限。鑒于其他細菌病原體的質控濃度范圍通常包括3～4個濃度，假設質控范圍的上限對應于所有藥物的臨界濃度，這意味著至少需要5～6個濃度才能確保質控菌株H37Rv濃度范圍符合這一通用標準，即包括質控范圍下限以下的一個濃度和臨界濃度以上的一個濃度。

技術專家小組承認對于大多數抗結核藥物而言，細分藥物的耐藥水平在現階段更多的是科研用途而非臨床診斷，因此，不應為了刻意引入額外的高于臨界濃度的臨床折點而舍棄其他藥物。但是對于以下這些藥物的臨床折點的作用已被WHO承認或將在近期進行推薦，因此應該納入。如左氧氟沙星(Lfx)應至少包含臨界濃度(1 mg/L)以上的兩個濃度，以便作為Mfx高濃度耐藥檢測的替代。再如INH，目前利用基因型方法依據不同的耐藥基因及位點的突變可以進行耐藥水平的區分，但表型藥敏試驗并未設置臨床折點。如果要推薦一個濃度用于區分僅有inhA啟動子區域突變的低水平耐藥和其他突變導致的高水平耐藥，其臨床折點可能需要設置在高于臨界濃度(0.125 mg/L)三個濃度的位置(如1 mg/L)。而如果認為katGS315T突變的菌株也有可能獲益于高劑量INH治療，那么還需要增加額外更高的濃度。高劑量RFP治療也在評估中，對于臨界rpoB耐藥導致的輕微的MIC水平增高，增加RFP劑量可能有效。雖然這項評估結果預期短期內無法獲得，但是包含ECOFF之上3～4個濃度有助于日常收集數據以便獲得更多的證據。另外，如果卡那霉素(Km)作為阿米卡星(Am)的替代，那么Km需要包含ECOFF之上的一個臨床折點濃度。

經過分析各種藥物的特征，結合最新的結核病治療指南及藥物分組，在文件中列出了納入優化后的微孔板的藥物優先級別，分為非常高、高、中等、低、極低5個級別：(1)4種一線藥物除了乙胺丁醇為高外，其他均為非常高級別，但須注意吡嗪酰胺藥敏試驗由于需要酸性培養基，因此不適合納入同一微孔板。(2)A組藥物中Lfx/Mfx、貝達喹啉(Bdq)、利奈唑胺(Lzd)均為非常高級別，同時提出Lfx耐藥檢測可作為Mfx耐藥檢測的替代。(3)B組藥物中氯法齊明(Cfz)屬于非常高級別，環絲氨酸(Cs)為高級別，特立齊酮(Trd)耐藥檢測可以使用Cs作為替代。(4)C組藥物中僅有德拉瑪尼(Dlm)是最高級別，乙硫異煙胺(Eto)為高[同時替代丙硫異煙胺(Pto)的耐藥檢測]，Am中等且推薦由Km的耐藥檢測替代，鏈霉素(Sm)、對氨基水楊酸(PAS)、亞胺培南-西司他丁(Imp-Cln)和美羅培南(Mpm)均為低優先級別。(5)其他組別藥物中普瑞瑪尼(PMD)為非常高優先級別，但目前并未建立相應的方法，利福噴丁耐藥檢測可以由RFP替代，而利福布汀是極低級別，氧氟沙星等同于Lfx，Km可以作為Am的替代，卷曲霉素不需要納入。

綜合以上各個藥品優先級別及替代檢測藥品，同時考慮判讀結果時讀板的簡便性，認為一塊96孔微孔板上最多能包含12種藥品，分別是RFP、INH、EMB、Lfx、Bdq、Lzd、Cfz、Cs、Dlm、Eto、PMD、Km。文中后續還列出每種藥品在結核病治療中的作用及地位，同時也指明了其藥敏試驗存在的問題和特點，并解釋了采用某些藥品替代另一種藥品藥敏試驗的可行性及理由，但也指出了這種替代性方法存在潛在問題和風險。

3.藥物位置布局及濃度設置的考慮問題：文件推薦了臨時的藥物及濃度布局框架，但須注意這僅是現階段臨時推薦，仍然需要更多研究驗證。現階段推薦的藥物位置布局及濃度設置主要從以下幾方面考慮：(1)平衡對照孔放在左上角的好處及風險后，將陰性和2個陽性對照生長放在最左上角。(2)96 孔微孔板每列設置一個藥品，以盡量減少結果判讀時的錯誤。(3)對于重要性相對低的藥品如EMB、Eto，將其安排在微孔板的最外側，因為如果孵育過程中由于液體蒸發而影響結果判讀時，相對其他藥品來說這兩個藥品重要性要低一些。(4)與其他成熟的表型藥敏試驗方法比，目前對于微孔板法的很多藥物的ECOFF仍缺乏全面和系統的評估。考慮到現階段各微孔板法的多樣性，文件提出需要著重考慮的因素包括：①盡可能考慮到藥物分組及共同的耐藥機制，如Lfx的ECOFF僅用于定義檢測Lfx耐藥和低水平Mfx耐藥，而臨床折點僅作為Mfx高水平耐藥檢測的替代。Km的ECOFF為4 mg/L，但僅作為參考，臨床已很少應用Km，8 mg/L 的臨床折點濃度將用作Am耐藥性檢測的替代。②新型藥物的ECOFF值并不完全確定。Bdq的ECOFF目前也有不同的觀點，如0.125 mg/L和0.25 mg/L。而對于Lzd，冷凍藥物微孔板的ECOFF為2 mg/L，但1 mg/L似乎更適合干燥的藥物微孔板。Lzd的H37Rv的質控范圍也需要更多研究，因其似乎比臨床菌株更加耐藥。Cfz、Cs的ECOFF目前也不是十分確定。考慮到Dlm的pWT的MIC分布≤0.008 mg/L，其目前的臨界濃度0.125 mg/L似乎太高，因此，為了更好定義pWT的MIC分布下限并設置質控范圍/目標，微孔板需要包括低至至少0.002 mg/L的濃度。可以預期的是，一旦確定了質控范圍的下限，Dlm的濃度范圍也將被重新優化。(5)雖然PMD的優先級別非常高，但迄今為止對該藥品僅在MGIT 960系統中進行了系統檢測。目前建議的濃度范圍僅作為評估在凍干藥粉微孔板方法中與MGIT相比是否匹配及在多大程度上偏移的初始濃度范圍。因此，現階段尚無推薦的臨界濃度。(6)對于Bdq和Cfz包含了ECOFF之上的2個或3個濃度以促進對Rv0678突變菌株的解釋。先前的研究對pWT分布進行建模時，未排除Rv0678突變菌株，而Rv0678突變導致mmpL5-mmpS5外排泵的高表達，如果泵是有活性的，表型非野生型菌株的MIC分布將會與pWT分布的右端重疊，從而可能導致高估pWT的MIC分布的第99百分位的濃度。

(三)方法學及結果判讀優化考慮事宜

1.方法學方面：文件中通過對現有商品化微孔板及其他方法的回顧發現方法學多種多樣。因此，提出幾項非常細節的措施以確保高質量檢測：(1)推薦藥物采用干燥而非冷凍形式，減少運輸對于冷鏈的需求。(2)使用U形底微孔板便于縮短閱讀時間，微孔板材質應由聚苯乙烯制成，以確保Bdq和Cfz可以準確測試，并且其表面應未經處理。不同類型的聚苯乙烯可能會影響一些藥物的MIC，故更換微孔板供應商也應受到監控。(3)微孔板應覆蓋半滲透密封膜，以提高生物安全性并最大限度地減少蒸發。(4)設置1個陰性生長對照孔及2個陽性對照孔(分別是100%和1%的接種菌懸液)。從視覺上突出顯示這3個孔(例如用不同顏色圈畫出)將最大限度地減少加液錯誤。在微孔板上顯示每列藥品的縮寫名稱可以最大限度地減少主觀讀板錯誤。最后，在板上標記臨界濃度或臨床折點有助于將注意力集中在這些閾值附近的孔的生長，當然這也可能導致一些偏倚。(5)微孔板法使用的7H9-OADC培養基不得含有孔雀綠，培養基嚴禁包括丙氨酸，因為會干擾Cs抗菌活性。也不能使用吐溫-80，會影響MIC值。當前使用的甘油可繼續應用，但需要繼續研究不包括丙酮酸時對于非洲分枝桿菌和動物適應性的結核分枝桿菌復合群其他成員生長的影響。(6)某些藥品必須使用二甲基亞砜(DMSO)來制備儲存液和隨后的稀釋液，確保藥品不發生沉淀(如Bdq和Cfz)。考慮到移液器頭并不是聚苯乙烯材質，故藥品稀釋步驟的多少可能也會產生影響。(7)使用符合國際標準化組織要求的濃度(即基于1 mg/L 的2倍稀釋系列)，并且必須能夠使用H37Rv進行質控測試來定義質控范圍和目標。(8)與比例法相比，微孔板法更容易出現接種菌懸液量的波動，可采取一系列措施來減少這種波動。如使用校準的濁度儀制備0.5麥氏濁度菌懸液，每次或定期進行細菌單克隆計數，制備菌懸液后應進行沉淀并將上清轉移至新管再比濁，以減少大塊菌落的干擾，減少生物安全風險。(9)由新鮮MGIT陽性培養物進行微孔板法的方法尚未成熟，使得微孔板法常規臨床的應用價值受到限制(因需要在固體培養基上進行長時間的傳代培養，從而更加延長結果報告時間)。(10)如果按照CLSI要求使用CO2將會阻礙該方法推廣使用，因為大多數基層實驗室不具備CO2氣體，因此，微孔板法應在普通空氣環境孵育下進行更多的驗證。未使用CO2可能會導致部分菌株在第21天沒有顯示出足夠的生長，但通過與1%生長對照進行比較，將會減少出現假陰性結果。(11)接種后第2或第3天應檢查微孔板是否被快速生長的微生物污染，以避免不必要的延誤。

2.結果判讀：關于結果判讀，雖然WHO目前將MIC定義為“在固體培養基或肉湯稀釋藥敏試驗中，能夠阻止99%以上微生物生長的抗菌劑的最低濃度”。但其他大多數病原菌定義為抑制肉眼所有可見生長的最低濃度(以下稱為“視覺臨界比例”)，而且所有美國ThermoFisher公司生產的微孔板，EUCAST推薦的參考方法及其他病原體的微孔板均以后者為準。因為即使在孵育結束時添加染料通過顯色法判讀，也無法用肉眼對1%的生長程度進行準確界定。此外，出于生物安全考慮，應避免使用顯色法，因為需要二次打開培養陽性的板子。另外，染料測試的是代謝活動，與觀察生長比較，染料不一定產生與視覺判讀生長可比的結果。

當然，對于MTB來說，選擇1%的臨界比例仍有其作用，如為了增加重復性，且這個臨界比例代表低于這個界值的耐藥菌株占比與臨床治療效果不存在相關性，但是同時技術專家組也承認至少對于新藥來說，沒有明確的證據表明更低比例耐藥菌占比用該藥物治療時有反應，而高于1%則是治療無反應。盡管1%的臨界比例看起來具有任意性，且沒有明確的臨床證據表明1%是最佳臨界比例，但技術專家小組同意微孔板法需要有一個約1%耐藥比例的檢測限。為了達到這一目的，推薦了EUCAST微孔板法中的關于讀取MIC的方法，使用濁度計進行菌懸液的準確定量，確保1%生長對照能在21 d內生長。此舉主要目的是盡量減少接種量的不確定性，并確保僅在生長對照足夠時讀板以檢測低頻率異質性耐藥。此外，大家一致認為應該在1%和100%對照孔陽性但陰性對照不生長時的最早的時間點讀板。具體來說，建議在第7、14和21天，而不是美國ThermoFisher公司目前推薦的第10天和第21天的組合，因考慮到如果周末無法判讀結果，原定的第10天讀板可能會因為延遲影響結果的判讀。選擇最早時間點讀板是為了盡量減小理論上設定的1%比例和實際視覺臨界比例的差異引起的MIC偏移的樣本比例。這一點很重要，因為結核分枝桿菌復合群的表型藥敏試驗都是從包含多個菌落的具有異質性的陽性培養物而不是從純化的單一的菌落中進行的。

二、微孔板微量肉湯稀釋法藥敏試驗在我國應用現狀及建議

該文件認為除吡嗪酰胺外，所有關鍵的抗結核藥物都可以排列在一個96孔板上，同時滿足必要的質控要求。但還存在一系列懸而未決的問題，包括替代藥物檢測的準確性等。技術專家組認為按照目前的共識而設計的微孔板法并經過持續的驗證后，與其他方法一樣基于對所有可用證據的全面綜合和評估，證明該方法能夠有效檢測出最重要的抗結核藥物與臨床顯著相關的耐藥性后，微孔板法可以得到WHO的認可。

雖然目前微孔板法并未經WHO推薦，但微孔板法已在包括我國在內的許多地區使用。目前我國應用的MTB耐藥性檢測商品化產品主要來自于4個廠商，除了MYCOTB板是進口商品外，其余3種均為國內產品。通過查閱分析其操作說明，4種商品包含藥物種類差異很大，濃度范圍設置更是不盡相同，操作方法包括讀板及結果報告也都不同。結合2021年我國表型藥敏試驗熟練度測試中使用微孔板法的實驗室的測試結果，發現大多數實驗室使用不同的微孔板產品在熟練度測試的藥物顯示了較好的結果，即耐藥/敏感檢出結果與標準結果的一致率較高。但是考慮到熟練度測試的菌株選取的是MIC值低的敏感株和MIC值高的耐藥菌株，不存在MIC的重疊，因此，在檢測臨床分離菌株，尤其是某些臨界突變導致耐藥的菌株時，可能會發生漏檢或誤判。其次，熟練度測試菌株中對于新藥的耐藥菌株非常少，高一致率可能掩蓋由于濃度范圍不適宜引起的潛在問題。

鑒于目前我國仍缺乏微孔板法標準化的方法，因此，建議我國首先對現有商品化產品進行系統的評估，并且評估時應選取有代表性的菌株和病例進行多中心評估。其次，建立國內的微孔板法標準化指南或者共識，參與制定人員應包含實驗室及臨床方面的專家。再次，廠商進行產品設計時宜參考WHO優化原則，同時也要參考我國臨床需要，并根據治療藥物的更新，對商品的上市后使用情況進行隨訪評估。最后，更重要的是我國科研及醫療工作者和廠商應積極協作產出自主的產品，并為全球提供科學、系統的中國證據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻夏輝：直接參與(醞釀和設計實驗)、文章撰寫(起草文章、對文章的知識性內容作批評性審閱)、工作支持(指導)；鄭揚：文章撰寫(起草文章)、工作支持(支持性貢獻)；宋媛媛：工作支持(行政、技術或材料支持)