脂質(zhì)運載蛋白2在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用

廖爭光， 衛(wèi)詩蕙， 杜丹玉， 孫 立， 袁勝濤

中國藥科大學 藥物科學研究院， 江蘇省新藥篩選重點實驗室， 南京 210009

糖蛋白作為細胞膜的結(jié)構(gòu)成分以及免疫細胞的抗原決定簇，在抵御多種疾病中起著關鍵作用。通常血液和尿液中的循環(huán)糖蛋白被用作生物標志物以檢測和跟蹤良性及惡性疾病的進展。近年來，一類被稱為“脂質(zhì)運載蛋白”的分泌糖蛋白，因在維持健康和對抗疾病方面起著關鍵作用而備受關注。其中，脂質(zhì)運載蛋白2(LCN2)作為部分良性和惡性腫瘤的生物標志物被廣泛報道。目前LCN2的相關研究主要集中于其作為腎損傷[1-2]、貧血[3]和癌癥[4]生物標志物的作用方面，而在肝臟疾病中的研究報道較少。本文擬對LCN2的生物學特性及其在生理和肝臟疾病病理狀態(tài)中的功能作用進行綜述，并探討LCN2作為肝臟疾病新的生物標志物和治療靶點的潛力。

1 LCN2概述

LCN2最初是從感染猴空泡病毒40的小鼠腎細胞培養(yǎng)物中純化所獲得，也被稱為中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)、噬鐵蛋白、α2-微量白蛋白相關蛋白或24p3蛋白，是脂鈣蛋白超家族的一種分泌糖蛋白，負責運輸循環(huán)中的親脂性小分子如類固醇、脂多糖、鐵和脂肪酸，在機體先天性免疫和病理過程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。LCN2的基因定位于人類9號常染色體(9q34)，編碼含197個氨基酸殘基的肽鏈(包括178個氨基酸殘基的成熟肽段)和19個氨基酸殘基的前導序列，其空間結(jié)構(gòu)是由N端的310-螺旋、C末端的α-螺旋，以及中間的八段反平行式β-折疊構(gòu)成保守的桶狀三級結(jié)構(gòu)[7-8]。LCN2主要以25 kD單體、二硫鍵相連的同源二聚體以及與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)9通過分子間二硫鍵形成共價的異源多聚體3種分子形式存在[6,9]。

LCN2主要表達于腎臟、子宮頸、骨髓、鼻咽、支氣管、胃、脾臟、唾液腺和皮膚等多種組織[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)在病理條件下，分泌LCN2的細胞數(shù)量增加導致LCN2在各種良惡性疾病中顯著上調(diào)，甚至與免疫防御無關。LCN2最初被認為是細菌感染期間由中性粒細胞分泌的急性期蛋白，Goetz等[11]注意到，從人類中性粒細胞中分離出的LCN2與細菌相關鐵載體結(jié)合，降低細菌中鐵的含量從而達到抑制細菌的作用。后來由于與炎癥的強相關性，LCN2被廣泛當作一種應激蛋白，細菌感染引起的炎癥和一些無菌性的炎癥均會導致機體LCN2的釋放增加[5]。此外，LCN2也是一種促炎性細胞因子，可作為急性腎損傷常用的生物標志物[12]。LCN2作用范圍還包括影響細胞凋亡[13]、脂質(zhì)代謝[14]、細胞遷移[15]、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。由于其能夠在腎損傷、肥胖、2型糖尿病、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移等多種疾病中發(fā)揮重要作用，故而受到越來越多的關注。

2 LCN2在肝臟疾病中的作用

2.1 LCN2與急性肝損傷 急性肝損傷通常是由病毒感染、毒素、酗酒和藥物中毒引起的一種肝功能迅速衰竭的肝病綜合征，病死率近80%[17]。通過小鼠注射CCl4以及大鼠進行膽管結(jié)扎誘導肝損傷建立實驗模型，發(fā)現(xiàn)LCN2在受損肝臟中表達顯著增加[18]。LCN2表達的增加與核因子-κB(NF-κB)的激活和促炎細胞因子IL-1β的釋放相關，提示LCN2可能是肝臟炎癥的早期生物標志物[18-19]。另有研究[20]表明，小鼠在注射CCl4或刀豆蛋白A后，其肝臟LCN2表達顯著上調(diào)，并與AST和ALT水平升高相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組小鼠相比，LCN2基因敲除小鼠在注射CCl4、脂多糖、刀豆蛋白A或膽管結(jié)扎時，肝損傷更加嚴重。具體表現(xiàn)為AST和ALT水平升高，IL-1β、IL-6、TNFα等多個炎癥細胞因子表達增加，從而導致STAT1、STAT3、NF-κB和JNK通路的持續(xù)激活。基于以上發(fā)現(xiàn)，提示LCN2在急性肝損傷中可能具有肝保護作用，具體機制有待進一步深入研究。

2.2 LCN2與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) NAFLD不僅僅是一種肝臟疾病，而且與心血管疾病、慢性腎臟疾病、2型糖尿病、肥胖和血脂異常有關[21]。在脂肪變性的早期階段，可以通過改變生活方式，包括改變飲食習慣和加強體育鍛煉實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)；然而，由于一些特定的分子改變以及不同的免疫細胞激活，可能導致NAFLD發(fā)展至非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌(HCC)[21]。LCN2與肥胖、胰島素抵抗和糖尿病相關[22]，提示其有可能作為評估脂肪肝疾病的生物標志物。Auguet等[23]檢測了正常肥胖女性和NAFLD(NASH或單純脂肪變性)肥胖女性肝臟中LCN2的基因及其蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)NAFLD肥胖女性肝臟中LCN2的基因和蛋白表達水平均上調(diào)，且肝臟LCN2基因表達與單純脂肪變性相關，LCN2蛋白表達水平與NASH相關。另一項針對中國受試者進行的研究[24]顯示，與正常健康人相比，NAFLD患者的血清LCN2水平升高，并且LCN2表達水平與炎癥和胰島素抵抗程度相關。Milner等[25]研究表明，在NAFLD中LCN2水平與肝臟炎癥程度、肝纖維化階段以及胰島素抵抗相關。

隨后有大量研究通過體外和體內(nèi)模型探討了LCN2在NAFLD發(fā)病機制中的具體作用。Xu等[26]在肝細胞中過表達LCN2，發(fā)現(xiàn)其可促進脂肪分解和脂肪酸氧化，表明LCN2可以抑制脂肪從頭生成、脂質(zhì)過氧化、脂質(zhì)攝取和細胞凋亡，從而預防NASH。另有體外研究[23]發(fā)現(xiàn)通過促炎的TNFα、IL-6和抵抗素處理可導致HepG2細胞中LCN2的表達上調(diào)。因此，LCN2表達上調(diào)被認為是肝臟對炎癥的保護性反應。Semba等[27]使用FLS(fatty liver Shionogi)小鼠作為NASH模型，與DS(dd Shionogi)單純性脂肪變性小鼠相比，結(jié)果顯示NASH組小鼠肝臟中LCN2表達明顯升高，同時伴隨趨化因子CXCL1和CXCL9表達升高，且發(fā)現(xiàn)LCN2主要由炎癥細胞簇中存在的肝細胞表達；作者進一步通過蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine and choline defificient，MCD)飲食建立NASH小鼠模型，與野生型對照組相比，LCN2基因敲除小鼠肝臟中的中性粒細胞和白細胞募集顯著降低，證明損傷誘導的LCN2上調(diào)可能是一種內(nèi)在的“幫助”信號，在機體受損時，LCN2將大量炎癥細胞招募至損傷組織中[28]。另一項研究[14]同樣應用MCD飲食誘導野生型小鼠和LCN2基因敲除小鼠建立NASH模型，與野生型對照組相比，喂食MCD飲食的LCN2基因敲除小鼠在肝臟中積累了更多的脂滴，進一步研究發(fā)現(xiàn)LCN2能夠通過誘導對脂滴形成重要的Perilipin5蛋白來維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

如上所述，盡管已有大量研究將LCN2描述為肝臟中的一種肝保護因子，但是，Ye等[29]通過高脂肪和高膽固醇飲食或MCD飲食誘導小鼠NASH模型，發(fā)現(xiàn)LCN2作為一個中心介質(zhì)，通過誘導趨化因子受體CXCR2導致ERK1/2的激活和促炎趨化因子的產(chǎn)生，從而促進中性粒細胞和肝巨噬細胞之間的串擾，加劇NASH。由于目前尚未提出LCN2在NAFLD中發(fā)揮作用的確切機制，未能證明LCN2是NAFLD導致的結(jié)果還是其主要驅(qū)動因素，因此對LCN2在NAFLD中的治療作用仍有爭議。以上研究表明，LCN2是NAFLD的可靠生物標志物，但需要進一步的研究來闡明LCN2在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用。

2.3 LCN2與酒精性肝病(ALD) ALD是指長期過量飲酒導致肝臟的組織病理學改變，從單純脂肪變性到酒精性脂肪性肝炎(ASH)、肝纖維化、肝硬化和HCC。慢性酒精攝入促進乙醛等活性氧部分在肝臟中積累，導致肝細胞代謝受損、慢性氧化應激、脂質(zhì)過氧化、肝細胞損傷和死亡[30]。與主要局限于酒精性肝硬化或單純脂肪變性的患者相比，ASH患者表現(xiàn)出肝臟LCN2免疫反應性增加。同樣，喂養(yǎng)乙醇的小鼠表現(xiàn)出肝臟中白細胞，特別是中性粒細胞LCN2表達增加，而在單核細胞和Kupffer細胞中表達較低。與喂養(yǎng)乙醇的野生型小鼠相比，LCN2基因敲除小鼠肝臟中的中性粒細胞浸潤和肝脂肪變性減少，肝損傷程度減輕[31]。在慢性酒精刺激期間，中性粒細胞來源的LCN2決定了肝臟中性粒細胞的遷移。以上發(fā)現(xiàn)證明LCN2驅(qū)動乙醇誘導的中性粒細胞浸潤，并加快ALD的進展，LCN2中和抗體治療可減輕酒精刺激后的肝損傷和中性粒細胞浸潤[31]。但是，也有研究[32]表明，在ALD患者和酒精性脂肪肝小鼠模型中肝臟沉默調(diào)節(jié)因子2通過介導賴氨酸102和211位點的去乙酰化降低了CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer-binding protein beta，C/EBPβ)的泛素化，增強了該蛋白的穩(wěn)定性，進而上調(diào)C/EBPβ靶基因LCN2的轉(zhuǎn)錄，促進LCN2表達。LCN2反之亦可以防止由酒精引起的肝脂肪變性、脂質(zhì)過氧化和肝細胞凋亡，進而保護小鼠免受酒精誘導的肝損傷。此外，肝細胞特異性過表達LCN2可通過抑制肝臟脂質(zhì)過氧化和肝細胞凋亡來預防及改善酒精性肝損傷[32]。上述研究提示LCN2在ALD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，LCN2可以減少由酒精引起的肝脂肪變性、脂質(zhì)過氧化和肝細胞凋亡，但同時又驅(qū)動酒精刺激誘導中性粒細胞浸潤，因此需要進一步的研究來闡明LCN2在ALD中發(fā)揮作用的具體機制，為ALD的治療提供新的策略與思路。

2.4 LCN2與肝纖維化、肝硬化 肝纖維化是由肝炎病毒感染、酗酒或NASH等多種原因引起的慢性肝損傷導致的組織瘢痕愈合反應的結(jié)果，可逐步進展至肝硬化和HCC[33]。肝星狀細胞(HSC)負責產(chǎn)生大部分的細胞外基質(zhì)，并在肝纖維化形成中起著核心作用。Ariza等[34]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，肝硬化患者尿液中LCN2顯著增加，從而將尿液LCN2作為肝硬化的預后標志。Kim等[35]在HCV感染的肝纖維化患者的尿液樣本中發(fā)現(xiàn)LCN2的含量與纖維化和肝硬化評分相關。Chen等[36]研究顯示，與健康人相比，肝纖維化患者的肝臟和血清中LCN2表達大量增加，在健康人肝臟中，LCN2僅在單核細胞中表達，而肝纖維化患者LCN2不僅在單核細胞中表達，也在肝細胞中明顯表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，LCN2通過HIF1A-ET1軸促進肝纖維化進展，LCN2基因敲除小鼠免受乙醇或CCl4暴露引起的肝纖維化[36]，提示LCN2可能是一個新的肝纖維化和肝硬化的治療靶點。

2.5 LCN2與HCC 在我國原發(fā)性肝癌90%以上為HCC，肝內(nèi)膽管癌和肝細胞及膽管混合癌各占不足5%[37]。有充分的證據(jù)表明LCN2在乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌以及各種腺癌和白血病中表達顯著上調(diào)[5]，然而，與原發(fā)性腫瘤相比，部分轉(zhuǎn)移性腫瘤的LCN2表達降低[38]。在一項對300例受試者的研究[39]中發(fā)現(xiàn)，與正常對照組、肝硬化患者和慢性肝炎患者相比，LCN2在HCC患者中的表達顯著增加；與常用的甲胎蛋白相比，血清LCN2不僅能夠作為HCC診斷標志物，而且能夠更準確地區(qū)分HCC和肝硬化受試者。這與埃及的一項研究[40]結(jié)果一致，該研究表明尿液中的LCN2水平也可以作為HCC的診斷標志物。另有研究[41-42]顯示LCN2不僅可以作為HCC的診斷標志物，而且發(fā)現(xiàn)血清LCN2濃度高于217.5 μg/L與HCC患者的病死率相關，LCN2和LCN2受體表達的升高與HCC患者的腫瘤分期、血管浸潤狀態(tài)以及腫瘤復發(fā)呈正相關，表明LCN2可能是HCC預后不良的標志物。

大多數(shù)研究集中于確認LCN2可作為HCC的生物標志物，但也有一些研究集中于確定它在HCC中的作用。有研究[15]發(fā)現(xiàn)過表達LCN2能夠增強腫瘤細胞的遷移和侵襲，相反，在腫瘤細胞系中敲低LCN2抑制了腫瘤細胞系在體外和體內(nèi)的遷移和侵襲。進一步研究發(fā)現(xiàn)，LCN2的過表達抑制E-鈣黏蛋白，并激活p-Met和p-FAK，而其缺失可增強E-鈣黏蛋白的表達，抑制p-Met和p-FAK蛋白以及MMP-9和MMP-2的活性，從而促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[15]。同時，Yao等[43]發(fā)現(xiàn)HCC中NF-κB信號通路異常激活上調(diào)LCN2的表達，LCN2大量消耗鐵，從而導致腫瘤細胞對鐵死亡誘導劑不敏感，LCN2中和抗體治療增強了索拉非尼對LCN2高表達HCC患者來源的異種移植瘤的鐵死亡誘導和抗癌作用。上述研究表明LCN2是影響腫瘤進展和侵襲性的因素之一，提示其可作為肝癌治療的潛在靶點。

然而，其他一些研究[13,16,44]表明LCN2在HCC中可能具有抗腫瘤作用。Wang等[16]研究顯示LCN2至少部分通過表皮生長因子或TGFβ1/LCN2/Twist1信號通路負向調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，這一發(fā)現(xiàn)表明LCN2是一種轉(zhuǎn)移抑制因子，可能使其成為一個潛在的治療靶點。也有學者[44]將LCN2歸類為一種腫瘤抑制因子，因為LCN2能夠通過抑制JNK和PI3K/AKT信號通路來減少HCC細胞的增殖和侵襲。研究[13,44]發(fā)現(xiàn)在SK-Hep-1和Huh-7細胞中過表達LCN2可顯著降低腫瘤細胞的活力，引起腫瘤細胞周期阻滯，促進HCC細胞凋亡。盡管在HCC中LCN2的作用尚不一致，但LCN2在HCC中的多種作用表明其可能是HCC治療中一個很有前途的靶點。

3 小結(jié)與展望

通過總結(jié)LCN2與肝臟疾病關系的相關研究，發(fā)現(xiàn)LCN2在急性肝損傷、NAFLD、ALD、肝纖維化、肝硬化和HCC等肝臟疾病中表達顯著上調(diào)，支持了其可作為各種肝臟疾病的一個良好的生物標志物的觀點。然而，目前仍未開發(fā)出針對LCN2設計的分子靶向藥物或抗體，LCN2水平的失調(diào)是否反映了其在肝臟疾病發(fā)病機制中的重要作用尚待闡明。進一步探索LCN2在肝臟疾病發(fā)生、進展和潛在消退中的作用以及其調(diào)控機制可能為肝臟疾病的藥物開發(fā)與臨床研究提供理論參考。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：袁勝濤、廖爭光負責研究選題；廖爭光、衛(wèi)詩蕙負責設計論文框架，起草論文；杜丹玉負責修訂論文；孫立負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。