與前列腺癌恩雜魯胺耐藥相關鐵死亡基因的生物信息學分析

葉大文，張兆存，趙海鋒，王碩，姜先洲

山東大學齊魯醫院泌尿外科，濟南250012

2020年全球癌癥統計中，前列腺癌已成為第三大常見癌癥，其病死率約占全球男性癌癥相關死亡的7%［1］。目前，內分泌治療是轉移性前列腺癌的標準療法，但部分患者會在治療18～24個月后發展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）。恩雜魯胺作為第二代雄激素受體抑制劑，已成為許多臨床中心治療CRPC的一線選擇。不過，雜魯胺雖然可以延遲CRPC的進展，但僅可維持患者4～6月的總生存期，這在一定程度上與抗雄治療后恩雜魯胺耐藥有關，其確切機制尚不清楚［2］。鐵死亡作為調節性細胞死亡中的一種，主要特征是鐵離子的積累和脂質過氧化物在膜上的聚集［3］。有研究發現，具有固有或獲得性耐藥的腫瘤細胞對鐵死亡高度敏感，且鐵死亡與腫瘤免疫治療的效果密切相關［4］。因此，探索鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的具體機制，尋找潛在的干預靶點及預后標志基因，對開發有效的CRPC干預措施至關重要。2021年3月—2022年3月，本研究通過生物信息學方法篩選與前列腺癌恩雜魯胺耐藥相關的鐵死亡差異表達的基因，并從中進一步尋找具有獨立預測價值的預后標志基因，以期能為探索鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的基礎和臨床試驗提供一定參考和方向。

1 材料與方法

1.1 鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達基因篩選從GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載恩雜魯胺耐藥與未耐藥的前列腺癌細胞測序基因集GSE104935和GSE78201，以P＜0.05及|log2FC|≥1作為條件篩選差異表達基因。通過FerrDb數據庫（http：//www.zhounan.org/ferrdb）收集鐵死亡相關基因，包括驅動基因、抑制基因及標記基因。將GSE104935、GSE78201基因集篩選出的差異表達基因及FerrDb數據庫收集到的鐵死亡相關基因通過ImageGP維恩圖工具取交集，得到鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的差異表達基因。

1.2 鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達基因的GO功能與KEGG作用通路分析將篩選出的鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達基因通過R軟件的“clusterprofiler”包進行GO功能（包括生物過程、分子功能、細胞成分）和KEGG作用通路富集分析，以校正后P＜0.05作為篩選標準，得到差異表達基因顯著富集的功能與作用通路。

1.3 鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預后標志基因篩選選取美國癌癥研究所及美國人類基因組研究所收集處理的關于前列腺癌的測序數據和臨床數據TCGA-PRAD，通過R軟件在TCGA-PRAD根據前列腺癌患者的臨床預后情況對鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達基因進行單因素、多因素Cox回歸分析，取單因素、多因素Cox回歸分析中P均＜0.05的差異表達基因作為鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預后標志基因。

1.4 預后標志基因表達及其預后預測價值分析

利用R軟件的survival包在TCGA-PRAD隊列中分析鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預后標志基因的表達水平，以預后標志基因在前列腺癌組織中的表達中位數為界，將患者分為預后標志基因高表達者、預后標志基因低表達者。Kaplan-Meier法比較預后標志基因高、低表達者的總生存期（OS）、無進展生存期（PFI）和疾病特異性生存期（DSS）。利用R軟件“survivalROC”包繪制預測患者1、3、5年OS、PFI的受試者工作特征（ROC）曲線，通過曲線下面積（AUC）評價預測效能。

2 結果

2.1 鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達基因篩選結果GSE104935基因集中共收集到1 278個恩雜魯胺耐藥性前列腺癌差異表達基因，GSE78201基因集中共收集到451個恩雜魯胺耐藥性前列腺癌差異表達基因，FerrDb數據庫共收集到259個鐵死亡相關基因；使用Image GP維恩圖取交集后共獲得鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的差異表達基因31個，分別為LAMP2、VEGFA、ACSF2、EGFR、DNAJB6、ZFP69B、GDF15、TUBE1、ARRDC3、SETD1B、NOX1、SLC38A1、ALOX5、ATG3、MAP1LC3A、GABARAPL1、ATG13、BID、EPAS1、PTGS2、GPX2、SLC1A4、XBP1、RGS4、HSD17B11、GABPB1、AKR1C2、AKR1C3、GCLC、MT1G、ACSL3。見OSID碼圖1。

2.2 鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達基因的GO功能與KEGG作用通路分析結果GO功能分析顯示，鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達基因主要富集的生物過程為營養水平反應、細胞對外界刺激的反應、氧化應激反應、細胞對酸性化學物質的反應、酸性化學品反應，主要富集的細胞成分為自噬體膜、次級溶酶體、自噬體，主要富集的分子功能為類固醇脫氫酶活性、醛醇NADP+1-氧化還原酶、酰CoA連接酶活性、NADP+活性、作用于NADPH的氧化還原酶活性；KEGG作用通路分析顯示，鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達基因主要富集的作用通路為花生四烯酸代謝、自噬、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、鐵死亡、神經變性疾病。見OSID碼圖2。

2.3 鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預后標志基因篩選結果單因素Cox回歸分析顯示，LAMP2、NOX1為鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預后關鍵基因（P均＜0.05），見OSID碼圖3；多因素Cox回歸分析顯示，VEGFA、LAMP2為鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預后關鍵基因（P均＜0.05）。見OSID碼圖4。因此，選擇LAMP2為鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預后標志基因。

2.4 預后標志基因表達及其預后預測價值分析結果TCGA-PRAD隊列中LAMP2在前列腺癌組織中相對表達量低于正常組織（P＜0.05）。LAMP2低表達者OS、PFI均低于高表達者（P均＜0.05），DSS與高表達者差異無統計學意義。見OSID碼圖5。ROC曲線結果顯示，LAMP2預測前列腺癌患者1、3、5年OS的AUC分別為0.825、0.747、0.770，預測前列腺癌患者1、3、5年PFI的AUC分別為0.539、0.601、0.568。見OSID碼圖6。

3 討論

目前，多西他賽和恩雜魯胺是前列腺癌的一線治療手段，但40%～50%的前列腺癌患者對多西他賽的反應沒有顯示出實質性和持續的前列腺特異抗原下降，中位反應持續時間為6～9個月［5］；而恩雜魯胺盡管延遲了前列腺癌進展，但僅維持患者4～6個月的總生存期［2］。因此，本研究通過全面的生物信息學分析，識別鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌形成的潛在基因，預測治療靶點、生物標志物，以期為CRPC治療提供新的思路和見解。

本研究結果顯示，LAMP2為鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預后標志基因。LAMP2是溶酶體膜的主要蛋白組分，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，其中含有生物合成后細胞內靶向所必需的信息。研究發現，LAMP2及其剪接變體LAMP2A、LAMP2B、LAMP2C亞型均顯示出組織特異性表達［6］。本研究通過進一步分析發現，相對于PFI，LAMP2預測前列腺癌患者1、3、5年OS具有更高的效率，其AUC分別為0.825、0.747、0.770。由于前列腺癌的腫瘤特性，患者多因非腫瘤原因死亡，因此LAMP2預測前列腺癌疾病特異生存期DSS無統計學和臨床意義。

HAHM等［7］研究顯示，蘿卜硫素可通過激活LAMP2 RNAi和促凋亡蛋白Bax來抑制前列腺癌細胞的死亡。另有研究表明，LAMP2能夠降低胞質半胱氨酸的濃度，導致細胞中谷胱甘肽降低、線粒體脂質過氧化，從而使細胞抗氧化能力下降產生氧化應激，通過鐵死亡機制誘導細胞死亡［8］。這提示LAMP2能夠通過氧化應激介導鐵死亡相關機制導致前列腺腫瘤細胞死亡。然而，有關研究發現在前列腺癌不同病理階段，LAMP2的表達存在一定差異。MORELL等［9］的研究發現，在神經內分泌前列腺腫瘤細胞中LAMP2表達上調，敲低LAMP2后可顯著阻斷細胞自噬，阻止神經內分泌前列腺腫瘤細胞分化，降低腫瘤細胞存活率，提示LAMP2的高表達能促進前列腺癌神經內分泌分化。上述研究給我們帶來了新的思考：是否LAMP2的表達水平可影響前列腺癌由腺癌或低分化癌向神經內分泌轉化？但這需要大量的基礎研究和臨床試驗提供更多依據。

鐵在內穩態和疾病條件中起到了決定細胞命運的關鍵作用，細胞內的游離鐵具有劇毒，是鐵死亡的顯著特征。溶酶體作為鐵穩態維持的樞紐，整合來自不同亞細胞位點的代謝和細胞死亡信號，已成為控制鐵相關代謝途徑的信號中樞［10］。鐵死亡由脂質過氧化物的過度產生導致的膜完整性受到破壞而引發，改變鐵代謝、對氧化應激的反應或脂質過氧化物的產生均可誘導鐵死亡［11］，這提示氧化應激與鐵死亡調控機制有密切相關性，其均是腫瘤發生和進展的關鍵步驟［12］。本研究中鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達基因的GO-KEGG通路富集分析提示其功能多集中在氧化應激反應、自噬體、溶酶體、鐵死亡和神經變性疾病方面。LAMP2本身作為溶酶體膜的主要蛋白組分，是含量最豐富的溶酶體膜蛋白，是新陳代謝、生物發生、信號轉導和細胞內穩態所必需的蛋白。這提示LAMP2可能是連接溶酶體—氧化應激—鐵死亡的關鍵基因，其可能在前列腺癌發生、進展，恩雜魯胺耐藥形成，甚至神經內分泌轉化過程中起到重要作用，但相關功能與機制仍需要大量基礎實驗研究。

綜上所述，本研究基于生物信息學方法篩選鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達基因，并明確了LAMP2這一關鍵基因具有獨立的預后價值，可作為潛在治療靶點和預后標志物。然而LAMP2在鐵死亡相關恩雜魯胺耐藥前列腺癌中分子作用機制和相關信號通路尚不清楚，仍需進一步研究。