劉玉玲，劉利，鄧佳麗，郭祉良

(1.山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽 032200；2.山西省汾陽醫院，山西汾陽 032200）

蟾蜍靈是傳統中藥蟾酥的主要活性成分之一，具有抗癌、鎮痛等多種作用[1]。目前研究發現蟾蜍靈可作用于腫瘤，但其研究過程中對正常細胞毒副作用的報道卻較少[2-5]。本研究通過蟾蜍靈處理體外培養的人胃黏膜上皮細胞GES-1，了解蟾蜍靈對GES-1細胞的毒性作用，為其應用于臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟾蜍靈（含量≥98%，MB7115），大連美倫生物科技有限公司，使用時用無水乙醇配成1 mmol/L的母液，根據使用需要將母液稀釋為相應濃度；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（penicillin-streptomycin）（批號：B540732）、乙醇（批號：A500737）、DMEM培養基（批號：E600003），胰蛋白酶（批號：A003702），噻唑藍（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT）（批號：A100793）、二甲亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）（批號：A100231），生工生物（上海）股份有限公司；小牛血清（批號：11011-8611），杭州四季青生物工程材料有限公司。

人胃黏膜上皮細胞株GES-1為山西醫科大學汾陽學院檢驗系張笑添老師贈予。

1.2 儀器與設備

Galaxy 170S二氧化碳培養箱，德國Eppendorf公司；MX2型微孔板振蕩器，韓國FINEPCR公司；Infinite F50型酶標儀，瑞士Tecan公司；TG-16型離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Ti-S倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；DM500光學顯微鏡，德國Leica公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

GES-1細胞培養于含有10%小牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養基中，置于37 ℃、濃度為5%的CO2培養箱中。培養2～3 d，使細胞處于對數生長期，用0.25%胰酶消化，計數并放于培養箱中傳代培養。

1.3.2 MTT法檢測GES-1細胞抑制率

取對數生長期的GES-1細胞，加入培養基，充分混勻制成細胞懸液，接種于96孔板中，每孔2 000個細胞，100 μL/孔，放置過夜。細胞貼壁后，分別加入蟾蜍靈（0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L），每組設立3個復孔，于37 ℃培養箱分別培養24 h、48 h、72 h后，向每孔中加入20 μL MTT溶液（工作濃度為5 mg/mL）混勻繼續培養4 h后，小心吸棄孔中培養基，向每孔中加入150 μL DMSO，放置10 min。用酶聯免疫標記儀在450 nm處測定吸光值（OD），實驗重復3次，計算細胞生存率。

1.3.3 細胞形態學觀察

細胞接種于96孔培養板中，培養過夜，細胞貼壁后加入不同濃度的蟾蜍靈（0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L），培養48 h后，放置在光學顯微鏡下進行觀察拍照。

1.3.4 細胞內ROS含量的檢測

采用熒光探針DCFH-DA檢測GES-1細胞內活性氧（ROS）含量，終濃度為10 μmol/L。DCFH-DA被ROS氧化為二氯熒光黃（DCF），產生綠色，通過細胞內DCF的熒光強度，即可相對定量細胞內ROS的水平。實驗時，細胞接種于96孔培養板中，培養過夜，細胞貼壁后加入不同濃度的蟾蜍靈（0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L），培養48 h后，用無血清培養基清洗細胞3次，向細胞中加入100 μL稀釋好的DCFH-DA工作液，于37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，然后用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，放置熒光顯微鏡下觀察DCFH-DA的熒光。

1.4 統計學方法

采用GraphPad Prim6統計軟件進行數據分析，所有數據均以（±s）表示；采用t檢驗對不同實驗組之間的數據進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同濃度蟾蜍靈對人胃黏膜上皮細胞GES-1生存率的影響

以 0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L濃度的蟾蜍靈作用GES-1細胞24 h、48 h和72 h后，通過MTT檢測細胞的生長水平。如圖1所示，在蟾蜍靈處理細胞24 h時，與對照組（0 nmol/L）相比，1～100 nmol/L的蟾蜍靈對GES-1細胞無殺傷作用（P＞0.05）；而蟾蜍靈作用細胞48 h和72 h時，隨著藥物濃度的增加，與對照組（0 nmol/L）相比，GES-1細胞的生長受到了明顯抑制，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。結合實驗結果和參考文獻[6]，用0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L的蟾蜍靈處理細胞48 h進行后續實驗。

圖1 不同條件下蟾蜍靈對GES-1細胞生存率的影響

2.2 不同濃度蟾蜍靈對GES-1細胞形態的影響

如圖2所示，蟾蜍靈濃度為0 nmol/L時，細胞的形態呈梭形，且細胞密度較高；隨著蟾蜍靈濃度的增加，GES-1細胞的形態由梭形向圓形轉變，體積減小，細胞的密度也相應降低。

圖2 不同濃度蟾蜍靈對GES-1細胞形態的影響

2.3 不同濃度蟾蜍靈對GES-1細胞中ROS含量的影響

細胞中綠色熒光的強度可反應細胞內ROS含量的變化。如圖3所示，隨著蟾蜍靈處理濃度的增加，GES-1細胞中綠色熒光的強度增加，表明高濃度的蟾蜍靈可以誘導細胞產生大量的ROS，使其含量增加。

圖3 不同濃度蟾蜍靈對GES-1細胞中ROS含量的影響

3 討論

許多研究報道，蟾蜍靈通過不同的途徑抑制肝癌、肺癌、腸癌以及胃癌等多種腫瘤細胞生長，誘導細胞的凋亡[2-8]。張瀅等[9]研究發現不同濃度蟾蜍靈在處理正常肝細胞LO224 h時，蟾蜍靈對正常肝細胞無殺傷作用，在48 h和72 h時，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，蟾蜍靈對正常肝細胞有一定的抑制作用。也有研究報道濃度小于20 nmol/L的蟾蜍靈作用正常宮頸細胞48 h時，對正常宮頸細胞的生長沒有抑制作用[5]。

本研究利用不濃度蟾蜍靈分別作用于人胃黏膜上皮細胞GES-1 24 h、48 h和72 h，結果發現，在處理24 h時，不同濃度的蟾蜍靈對GES-1細胞無殺傷作用。但是隨著作用時間的延長，蟾蜍靈表現出抑制GES-1細胞的生長并影響細胞形態，誘導細胞產生大量的ROS，而大量ROS是引起細胞內氧化損傷的重要因素，如造成DNA的損傷、蛋白酶活性的氧化等[10-11]。

目前針對腫瘤的治療方法多為手術切除和術后化療等，但該種方法治療效果差，且易于復發。因此，人們開始尋找有效的藥物進行治療，同時要最大限度地降低藥物對自身正常細胞的毒性。本實驗初步研究發現，低濃度的蟾蜍靈在一定的作用時間內，對正常胃黏膜上皮細胞無殺傷作用。這為蟾蜍靈以后作為腫瘤治療藥物提供了參考依據。