網絡藥理學篩選白頭翁治療腸阿米巴痢疾的潛在靶點

劉鑒，戴佳琳

（1.貴州醫科大學寄生蟲學教研室，貴州貴陽 550001；2.貴州醫科大學 法醫學院，貴州貴陽 550001）

阿米巴痢疾是一種常見的寄生蟲腸道感染，在全球均有流行。據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）統計，每年約有5 000萬人發生感染，可導致4萬～11萬人死亡，嚴重危害人們的身體健康和生命安全[1-3]。由于白頭翁（Pulsatilla chinensis）有清熱解毒、涼血止痢的功效，在臨床上治療細菌性痢疾和阿米巴痢疾均具有較好的療效，但由于具有多成分、多靶點、多途徑的特點，從單一角度評價其藥理機制具有一定的挑戰性[4-5]。本研究采用網絡藥理學及分子對接的方法，研究白頭翁治療阿米巴痢疾的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 數據來源

白頭翁主要成分數據來源于TCMSP數據，包括活性成分及其靶基因。腸道疾病相關基因從4個數據庫（Genecards數據庫、OMIM數據庫、PharmGkb數據庫和TTD數據庫）中檢索獲得。

1.2 實驗方法

1.2.1 有效成分及疾病靶標的篩選

白頭翁主要成分數據來源于TCMSP數據庫，配體篩選使用SwissADME工具。腸道疾病相關基因從Genecards數據庫、OMIM數據庫[6]、PharmGkb數據庫和TTD數據庫4個數據庫中檢索。使用SwissADME工具評估白頭翁的藥代動力學“ADMET”特性[7]，獲得關鍵的分子配體。

1.2.2 藥物有效成分和疾病靶標網絡的建設及核心基因的篩選

使用Cytoscape 3.8.0構建白頭翁有效成分調控網絡。利用DAVID進行GO和KEGG通路分析。使用R軟件4.0.2中的“ggplot2”包生成圖形，將白頭翁成分靶標和腸道疾病相關基因集上傳到STRING數據庫，并獲得網絡中的核心基因。

1.2.3 分子對接

采用AutoDockvina進行分子對接，選取自由結合能最低的結合構象，使用PyMol軟件和Discovery Studio軟件進行可視化處理。

2 結果與分析

2.1 白頭翁活性成分和潛在靶標的篩選

根據OB≥30%，DL≥0.18，從TCMSP數據庫中共篩選出9個活性成分，從CTD數據庫中共篩選出72個藥物靶基因。此外，從Genecards、OMIM、PharmGkb和TTD數據庫中檢索腸道疾病相關基因。收集藥物和疾病的交點靶點作為共同基因，其可能是治療中的潛在靶點，最終得到一組白頭翁靶基因和腸道疾病相關基因共68個。

2.2 白頭翁有效成分-靶點網絡構建

將9個有效成分和目標基因導入Cytoscape網絡可視化探索有效成分之間的關系和相應的靶基因，見圖1。計算的鏈接價值（學位價值）為靶基因的數量直接相關組件，高連鎖值表明該基因在網絡中處于關鍵位置。通過對其活性成分“ADMET”特性的評價，確定白頭翁的藥物代謝學特征。在9個有效成分中，Aureusidin（MOL001978）和Isorhamnetin（MOL000354）可以很好地被消化道吸收，但是Isorhamnetin是細胞色素P450（CYP）同工酶CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2的抑制劑，使其他藥物或本身代謝減慢，血藥濃度升高，提高藥效。因此，筆者推測Isorhamnetin在治療中可以起到關鍵作用。

圖1 有效成分-靶點網絡

2.3 富集分析及PPI網絡構建

富集分析發現，基因主要富集在類固醇激素的反應、調節膜電位、細胞內受體信號通路、IL-17信號通路、PI3K/Akt信號通路，表明白頭翁通過多種途徑作用于腸道系統。將目的基因導入到Cytoscape中，使用插件CytoNCA計算DC、BC、C、EC、NC 和 LAC共6個參數來評估交互網絡中節點的拓撲屬性。第一次篩選獲得19個節點和102個邊，第二次篩選獲得7個節點和19個邊（見圖2），最終獲得了7個重要基因（AR、CASP3、ESR1、HSP90AA1、JUN、PTGS2和RELA），涉及對類固醇激素的反應、調節膜電位、細胞內受體信號通路、IL-17信號通路、PI3K/Akt信號通路等。以上結果表明，白頭翁具有多成分、多靶標作用，其中RELA參與PI3K/Akt信號通路，該通路在調節細胞生長和凋亡中起重要作用。此外，還影響PI3K/Akt/NF-κB信號傳導，可改善腸道微生物群，達到緩解潰瘍性結腸炎的作用[8]。

圖2 PPI網絡的拓撲篩選過程

2.4 分子對接

將活性成分分別與大分子蛋白進行對接，發現化合物Isorhamnetin除了JUN無氫鍵連接外，其余均可與氫鍵相連形成穩定的化合物。其中化合物Isorhamnetin與RELA蛋白通過3個氫鍵分別與3個氨基酸殘基結合，呈現出緊湊的結合模式。化合物與殘基TYR-98形成鍵長為2.2 ?的氫鍵，與氨基酸殘基LYS-102形成距離為2.2 ?的氫鍵，與殘基GLU-49形成的氫鍵鍵長為2.8 ?。這些相互作用使得蛋白與化合物形成穩定的復合物（見圖3），由此可以推測白頭翁中Isorhamnetin與RELA結合后，通過抑制PI3K/Akt和NF-κB信號通路，以拮抗炎癥的發生發展，從而達到治療的目的。

圖3 對接結果可視化模式

3 結論

本研究采用網絡藥理學和分子對接方法，對白頭翁的活性成分及其分子機制進行了探討。其有效成分Isorhamnetin和7個大分子蛋白（AR、CASP3、ESR1、HSP90AA1、JUN、PTGS2和RELA）對接后，除了JUN無氫鍵連接外，其余均可與氫鍵相連形成穩定的化合物，表明白頭翁具有多成分、多靶標作用；白頭翁活性成分與RELA蛋白呈現出緊湊的結合模式，通過抑制PI3K/Akt和NF-κB信號通路后，以拮抗炎癥的發生發展。綜上，可推測RELA是治療腸阿米巴痢疾的潛在靶點。