蔓三七葉中綠原酸和異綠原酸的體外抑菌效果研究

胡居吾

（江西省科學院應用化學研究所，江西南昌 330096）

大腸桿菌（Escherichia coli）為典型的革蘭氏陰性桿菌，是一類人畜共患的病原體，一般不致病，為人和動物腸道中的常居菌，在一定條件下可引起腸道外感染，常引起嬰兒和幼畜（禽）嚴重腹瀉和敗血癥[1]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為典型的革蘭氏陽性菌，是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可在人體內產生腸毒素，從而刺激腸道，引起嘔吐、腹瀉、發熱等癥狀。酵母菌屬于真菌，在有氧和無氧環境下都能生長，在釀造、食品、醫藥工業方面占有重要地位，可以用來制造面包，生產酒精和含有酒精的飲料；在醫藥上將其制造成酵母片，用于治療消化不良等。但是，有些酵母菌對生物有害，對人體有致病性，比如白色假絲酵母菌（白色念珠菌）會生長在潮濕的陰道壁黏膜上引發陰道炎，也可能出現在口腔上引起鵝口瘡等，如果酵母菌在食品加工上應用量超標，也會引起食品腐爛變質，引發腸道疾病。

綠原酸是由咖啡酸（Caffeic acid）與奎尼酸（Quinic acid）生成的縮酚酸，異名咖啡鞣酸，化學名3-O-咖啡酰奎尼酸。綠原酸大量存在于咖啡、杜仲、金銀花中。研究表明，綠原酸主要具有抗菌、阻止病毒入侵等眾多功效[2-6]。異綠原酸是二咖啡酰奎尼酸類化合物，是一類由奎尼酸與數目不等的咖啡酸通過酯化反應縮合而成的有機酸類，包括異綠原酸A（3,5-二咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸B（3,4-二咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸C（4,5-二咖啡酰奎尼酸），廣泛存在于植物界中。主要的藥理活性有抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒等[7]。

蔓三七 [Gynura procumbens（Lour.）Merr.]為菊科菊三七屬植物，學名平臥菊三七，又名蛇接骨、續命草、神仙草，為多年生草本藥食兩用植物，2012年5月平臥菊三七被原衛生部批準為新資源食品，2019年批準為普通食品。近代藥理研究表明，蔓三七具有消炎、抗癌、降壓、降糖、降脂、抗菌、抗氧化的藥理活性。課題組對蔓三七葉（干葉，含水量為8.2%）中成分進行了檢測，其綠原酸含量3.05%，異綠原酸A含量0.37%、異綠原酸B含量0.65%，異綠原酸C含量0.29%。

到目前為止，大部分研究人員只研究了蔓三七中綠原酸的抑菌作用，而對蔓三七中異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C是否具有抑菌作用研究的不多。因此，本研究以抑菌圈直徑和最低抑制濃度為活性追蹤指標，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母菌為供試菌，研究了蔓三七中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的抑菌效果，為進一步深入研究蔓三七的功效提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

大腸埃希氏菌（CICC 10899），中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC）；金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、白色假絲酵母菌（ATCC10225），美國模式培養物研究所（ATCC）。

1.2 試驗材料

營養肉湯、營養瓊脂、伊紅美藍瓊脂培養基，上海锃嘉生物工程有限公司；蔓三七葉綠原酸（含量99.2%）、異綠原酸A（含量98.0%）、異綠原酸B（含量99.1%）、異綠原酸C（含量99.2%），實驗室自制。

1.3 儀器設備

DSHZ-300A型水浴恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設備有限公司；GNP-9160隔水式恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；QL-861型漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ELx800型酶標儀，美國BioTek公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；722型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-ICU雙人單面垂直潔凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 培養基的配制

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（細菌用培養基）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，pH調至7.2，蒸餾水定容至1 000 mL。

豆芽培養基（酵母菌用培養基）：黃豆芽100 g，葡萄糖50 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.4.2 菌懸液的制備

菌種活化之后用接種環挑取一環菌體或孢子放入50 mL無菌水中，加入玻璃珠，充分振搖2 min，制成含菌量109～1010cfu/mL的菌懸液或孢子懸浮液備用。

1.4.3 供液試液的配制

將蔓三七葉綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C各取0.25 g，分別用5 mL丙酮溶解得50 mg/mL的藥液，再以丙酮為溶劑對上述溶液分別進行2倍稀釋，每種萃取物得到50.0 mg/mL、25.0 mg/mL、12.5 mg/mL三個濃度梯度的供試藥液并用丙酮作為空白對照。

1.4.4 平板培養基的制備

將配制好的培養基高壓蒸汽滅菌冷卻至50～60 ℃，采用無菌操作倒入滅菌培養皿內，每培養皿裝15～20 mL即可,于4℃保存備用。

1.4.5 體外抑菌試驗

本試驗采用濾紙片法。選用直徑為12 cm優質濾紙，121 ℃高壓滅菌40 min，再經85 ℃烘干，置于干燥器中備用。取制備好的紙片分別放入不同濃度的供試液中，浸泡2 h后取出。每種濃度每個供試菌設3個重復。然后置于37 ℃恒溫培養箱中培養18 h，比較各自抑菌圈直徑，取平均值。抑菌圈越大表明抑菌效果越好。

1.4.6 最低抑菌濃度（MIC）的測定

采用微量肉湯稀釋法測定蔓三七葉綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C抑制3種供試菌的最低抑制濃度，采用4組96孔板進行行實驗，每組1種供試藥液，根據魏宇超等[8]的實驗方法進行培養實驗，培養結束后在600 nm處測量各供試液的OD值。與無藥有菌組進行比較，推算出每個樣品濃度下的細菌生長百分數，換算為細菌的百分比抑制率，以最少能抑制80%細菌成長（細菌生長百分數≤20%）的樣品最低濃度為其最低抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 對供試菌的抑制效果

由表1可知，綠原酸在濃度為12.5～50.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑是12.4～16.2 mm，對白色假絲酵母菌的抑菌圈直徑為12.4～16.8 mm，表明試驗濃度綠原酸對金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母菌具有較好的抑制效果；當濃度在25.0～50.0 mg/mL時，對大腸桿菌的抑菌圈直徑是12.4～14.5 mm，在濃度小于25.0 mg/mL時，對大腸桿菌有一定的抑制作用，但抑菌圈的直徑小于10 mm。

表1 綠原酸和異綠原酸的抑菌活性

異綠原酸A在濃度為50.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別是13.5 mm和12.5 mm；濃度低于50.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制效果不佳，沒有明顯的抑菌圈。在濃度為25.0～50.0 mg/mL時，對白色假絲酵母菌的抑菌圈直徑為12.7～14.1 mm；濃度小于25 mg/mL時，對白色假絲酵母菌的抑制作用也不明顯。

異綠原酸B在濃度為25.0～50.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果明顯，抑菌圈直徑分別是12.3～13.6 mm和13.0～15.3 mm；在濃度低于25.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制效果不佳，沒有明顯的抑菌圈；而異綠原酸B只有在高濃度（50.0 mg/mL）情況下，對白色假絲酵母菌才有抑制作用，此時的抑菌圈直徑是12.3 mm。

異綠原酸C在濃度為25.0～50.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯，抑菌圈直徑12.7～13.3 mm，在濃度低于25.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌抑制效果不佳，沒有明顯的抑菌圈；試驗濃度范圍內對大腸桿菌沒有明顯的抑制作用，只有在高濃度（50.0 mg/mL）情況下對白色假絲酵母菌才有抑制作用。表明異綠原酸C對金黃色葡萄球菌有一定的抑制效果，而對大腸桿菌和白色假絲酵母菌的抑制作用不明顯。

2.2 綠原酸和異綠原酸對供試菌的最低抑制濃度

由表2可知，綠原酸對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色假絲酵母菌的最低抑菌濃度分別為8.5 mg/mL、10.3 mg/mL和7.2 mg/mL，對白色假絲酵母菌的抑制效果略優于其他兩種菌。異綠原酸A對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色假絲酵母菌的最低抑菌濃度分別為30.5 mg/mL、32.6 mg/mL和20.5 mg/mL。異綠原酸B對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色假絲酵母菌的最低值抑制細菌濃度分別為22.2 mg/mL、23.1 mg/mL和33.2 mg/mL，對白色假絲酵母菌的抑制效果略差于其他兩種菌。異綠原酸C對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色假絲酵母菌的最低抑菌濃度分別為21.8 mg/mL、85.6 mg/mL和27.3 mg/mL，對大腸桿菌的抑制作用較差。整體來看，綠原酸的抑菌能力最強。

3 結論

蔓三七葉中綠原酸，異綠原酸A、B和C能起到一定的抑菌效果，主要可能通過改變供試菌細胞膜的通透性，破壞供試菌細胞壁的完整性，阻礙物質和能量的代謝及細菌蛋白合成，造成胞內電解質、酶及RNA、DNA的泄出，導致細胞的衰亡，從而發揮抑菌作用[7-8]。