亞砷酸鈉暴露對人甲狀腺Nthyori 3-1細胞焦亡相關蛋白表達的影響

王大朋，王仁珞，范麗麗

（貴州醫(yī)科大學 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室/公共衛(wèi)生與健康學院，貴州貴陽 550025）

甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌器官，對機體的生長發(fā)育、新陳代謝等均有重要作用，其功能損傷與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關。甲狀腺疾病病因復雜，除年齡、性別、遺傳等傳統(tǒng)因素外，環(huán)境因素對其影響亦引起國內(nèi)外研究人員廣泛關注[1]。砷是一種環(huán)境類金屬毒物，機體可通過呼吸道、食物和飲水攝入及皮膚吸收暴露于砷，可引起急、慢性砷中毒，導致多器官損傷[2]。近年來人群及動物研究發(fā)現(xiàn)，砷暴露與甲狀腺疾病發(fā)生發(fā)展密切相關[3-5]。但該方面研究目前尚處于起步階段，砷致甲狀腺損傷具體類型及發(fā)病機制均未見相關報道。本研究擬在體外層面探討砷暴露對人甲狀腺細胞焦亡相關蛋白表達的影響，為砷致甲狀腺損傷分子機制研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

正常人甲狀腺細胞Nthyori3-1，中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 儀器與試劑

INCO2108型CO2培養(yǎng)箱，德國Memmert公司；PowerPac HC型蛋白電泳儀系統(tǒng)，美國Bio Rad公司；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio Rad公司；Multiskan? GO型多功能酶標儀，美國Thermo Fisher公司。

亞砷酸鈉（NaAsO2），優(yōu)級純，美國Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，細胞級，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（FBS），北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白一抗，上海愛必信生物科技有限公司；GAPDH蛋白一抗，美國ImmunoWay公司；羊抗鼠/羊抗兔二抗，上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗分組

Nthyori3-1細胞接種于含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好，且處于對數(shù)生長期的細胞按5×105個/孔密度接種于 6孔板，將NaAsO2以 0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L的濃度梯度進行染毒，處理24 h；另外以4 μmol/L的NaAsO2處理Nthyori3-1細胞0 h、12 h、24 h、48 h。

1.4 Western-blot法檢測焦亡相關蛋白

到達各染毒終點收集細胞沉淀，RIPA裂解后16 000×g離心20 min，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。按說明書依次進行制膠、蛋白上樣（20 μg）、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，將相應蛋白一抗進行4 ℃孵育過夜后，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標記的二抗孵育90 min，ECL化學發(fā)光法進行顯影，Image J軟件進行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且具有方差齊性，數(shù)據(jù)均采用均值±標準差表示。采用單因素方差分析進行多組間比較，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同劑量NaAsO2對焦亡相關蛋白表達水平的影響

如圖1所示，隨著NaAsO2處理濃度的增加，Nthyori3-1細胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平均逐漸升高，其中NLRP3、GSDMD蛋白表達呈明顯劑量-反應關系（P＜0.05）。

圖1 不同劑量NaAsO2對Nthyori3-1細胞焦亡相關蛋白表達水平的影響

2.2 NaAsO2暴露不同時間對焦亡相關蛋白表達水平的影響

如圖2所示，與對照組相比，NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平隨染毒時間的延長均呈現(xiàn)明顯增加趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與12 h組相比，染毒24 h、48 h的NLRP3、GSDMD表達顯著上升（P＜0.05）。NLRP3在染毒48 h后的表達水平較24 h明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 NaAsO2暴露不同時間對Nthyori3-1細胞焦亡相關蛋白表達水平的影響

3 結論

人群流行病學和有限的動物實驗均發(fā)現(xiàn)砷暴露可對甲狀腺及其功能造成不同程度的損傷[3-6]。然而，砷暴露對體外人甲狀腺細胞的毒性作用目前未見相關報道。本研究以Nthyori3-1細胞為研究對象，探討砷暴露對其毒性作用及可能機制。

細胞焦亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種促炎性、程序性細胞死亡方式，由GSDMD分子被NLRP3炎癥小體剪切活化后在細胞膜上形成孔洞而導致其完整性破壞，釋放其細胞內(nèi)容物以及白介素等促炎物質(zhì)，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，進而造成細胞損傷[6]。炎癥小體主要由NLRP3、ASC及Caspase-1前體（pro-Caspase-1）組成。在內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激下，活化的Caspase-1能夠特異性切割GSDMD，使其生成C端和N端，GSDMD的N端與細胞膜上的磷脂結合，使細胞膜形成許多小孔，細胞的完整性遭到破壞，導致細胞腫脹、破裂，釋放細胞內(nèi)的炎性物質(zhì)，從而誘導細胞焦亡的發(fā)生[7]。

近年來，有限的研究發(fā)現(xiàn)砷可誘導不同細胞發(fā)生焦亡。LI等[8]用NaAsO2處理人肝L-02細胞，觀察發(fā)現(xiàn)IL-1β和活化的Caspase-1水平隨著染砷劑量的增加而增加。用NaAsO2處理肝癌細胞可以誘導其發(fā)生細胞焦亡[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，長期接觸NaAsO2可誘導TNF-α的產(chǎn)生，進而引起NLRP3介導的炎性細胞活化，誘導胰腺細胞發(fā)生細胞焦亡[10]。但是，砷對甲狀腺細胞焦亡的影響目前尚不清楚。本研究以人正常甲狀腺Nthyori 3-1細胞為研究對象，首次探討了不同濃度砷暴露不同時間對其焦亡相關蛋白表達的影響，結果顯示NaAsO2染毒Nthyori 3-1細胞后，其細胞內(nèi)的NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達量較對照組均顯著增加。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)無機砷能夠誘導甲狀腺細胞焦亡相關蛋白表達水平升高，進而可能引起甲狀腺細胞焦亡，具體機制有待進一步深入研究。