抗結團劑對CHO細胞懸浮培養的影響

張燕娜，章郭真，李剛

（1.復旦大學 生命科學學院，上海200438；2.上海濟煜醫藥科技有限公司，上海201203）

近年來，隨著生物醫藥行業的迅速發展，動物細胞生產的重組蛋白需求量急劇增加，中國倉鼠卵巢細胞（CHO）細胞已成為細胞表達單克隆抗體培養系統的重點和熱點。然而，人源化重組蛋白的加工只能通過哺乳動物細胞培養來實現，因此一個優質成功的細胞培養工藝對整個藥物開發過程顯得尤為重要[1]。為能滿足日益壯大的市場需求，大分子添加劑減少剪切損傷的使用，使懸浮培養得到廣泛應用[2]。在懸浮培養中，為了滿足營養成分的需求，20世紀90年代后，流加培養開始受到更多學者的青睞[3]。細胞培養工藝的改進和優化為細胞的大規模培養提供了助力。一個完整的工藝過程可以分為準備階段（設備的準備、清洗消毒、培養基的配制和過濾以及細胞種子的準備、擴增與檢測）、細胞培養階段（細胞接種、培養工藝參數設定、添加補料及其他添加物等）和產物收獲階段（培養上清液的預處理、蛋白測定及質量分析等），根據不同細胞株的特點，實際開發中培養工藝各有不同。

在懸浮培養中，細胞在次優的生長條件下會形成聚集，發生結團現象，導致細胞代謝出現異常，乳酸堆積，細胞存活率降低，影響蛋白表達產量及質量。對于細胞結團的問題，有研究認為結團可能是由于脫氧核糖核酸（DNA）從死亡的細胞間釋放后，在細胞與細胞之間架橋引起的，若在培養基中添加脫氧核糖核酸酶I（DNase I）可以避免結團現象的發生[4]。但是DEE等[5]則認為通過添加肝素、硫酸葡聚糖及硫酸戊糖等高度磺化硫酸聚陰離子物質，可成功解決BTITN5BI-4昆蟲細胞的結團問題，使蛋白表達量顯著提高。同時也有研究表明，添加濃度為25 mg/L的硫酸葡聚糖（分子量為5 000 Da）能避免細胞的結團現象，同時能提高最大細胞密度和蛋白表達量[6]。

細胞培養工藝的穩健是細胞培養放大和生產的關鍵。本文添加的抗結團劑為商業化產品，其主要成分是硫酸葡聚糖。在動物細胞培養過程中常會發生細胞結團現象，當發生黏附結團時，聚集團內的細胞微環境會發生惡化，出現供氧不足、代謝廢物積累、營養物質不足等問題，從而導致細胞的死亡。在實驗中添加主要成分為帶負電荷的硫酸葡聚糖的抗結團劑可以改變細胞表面的電荷，使細胞維持單細胞形態，從而改善其生存環境。然而，抗結團劑在細胞培養產物純化過程中需要去除并測定殘留量，加上抗結團劑價格昂貴，應用抗結團劑時除了要考慮工藝優化，還要注意降低成本。因此，本文對在細胞培養不同階段添加抗結團劑對細胞生長代謝、蛋白表達量及質量的影響進行了研究。

1 材料與方法

1.1 細胞株和培養基

本實驗所用的CHO-S和CHO-K1細胞由上海濟煜生物科技有限公司提供。

Dynamis無血清基礎培養基，美國Gibco公司；Cellboost7a/7b補料培養基，美國Hyclone公司；抗結團劑ACA，美國Gibco公司。

1.2 細胞培養

（1）種子鏈階段：分別復蘇CHO-S和CHO-K1細胞各2支，一支添加ACA，一支不添加，置于125 mL搖瓶，并在120 r/min、36.5 ℃、5%CO2以及70%濕度的搖床中進行培養，當細胞生長至2～4 d，進行一次傳代擴增，培養基及添加物與復蘇時保持一致。傳代擴增四代，進行流加培養階段接種。

（2）流加培養階段：將種子鏈傳代擴增至第四代的細胞接種至3 L生物反應器，初始培養體積1.2 L，pH控制在6.95±0.25，溶氧控制為40%，攪拌轉速為165 r/min。流加培養過程中通過補料補糖維持葡萄糖在0.5～7.0 g/L，每天取樣計數監測細胞生長狀態及生化指標。細胞培養至14 d，進行蛋白濃度分析，并對收獲液進行親和層析后，分析關鍵質量。

1.3 儀器與設備

Vi-cell XR型細胞存活率分析儀，美國Beckman Coulter公司；Multitron型二氧化碳搖床，瑞士Infors公司；Bioprofile Flex2型生化分析儀，德國Nova Biomedical公司；TSGP10型恒溫水浴鍋，美國ThermoFisher公司；ABL90 Flex型血氣分析儀，丹麥Radiometer公司；my-control型生物反應器，荷蘭Applikon公司。

1.4 分析方法

活細胞密度和細胞活率采用臺盼藍染色法。采用細胞計數儀自動計數，血氣分析儀檢測pH，生化分析儀檢測葡萄糖、乳酸和滲透壓。

抗體濃度采用HPLC-Protein A法檢測；抗體純度采用SEC-HPLC和CE-SDS分析；PI及電荷異構體采用iCIEF法分析。

細胞倍增時間（DT）代表細胞翻一倍所需的時間，是衡量細胞生長快慢的指標。DT按公式（1）計算。

式中：DT為倍增時間，h；t為培養時間，h；N0為接種后起始細胞數，個/mL；Nt為培養t時間后的細胞數，個/mL。

產物表達量Titer主要由單個細胞的產物比生產速率（Qp）和累計活細胞密度（IVCD）共同決定。其中單個細胞的產物比生產速率（Qp）代表細胞異源表達重組蛋白的能力。Qp和IVCD按公式（2）和公式（3）計算。

式中：Titer為產物表達量，g/L；Qp為單個細胞的產物比生產速率，pg/（個·d）；Dn和Dn-1分別為，；VCDn和VCDn-1分別為第n天和第n-1天活細胞密度，個/mL；IVCDn和IVCDn-1分別為第n天和第n-1天累計活細胞密度，個/mL；當n=0時，IVCD=VCD。

1.5 數據分析

采用GraphPad Prism7軟件的t檢驗分析添加和不添加ACA組細胞倍增時間之間是否存在顯著差異，P＜0.05表明有顯著性差異，反之差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 種子鏈階段

種子鏈細胞培養是將細胞液從凍存管中復蘇，隨著細胞密度的增長和活率的恢復，每隔2～3天換液擴增，直至達到接種生物反應器的需求量。種子鏈過程中細胞的密度一定程度上影響細胞擴增的代次，細胞的活率反映細胞的存活狀況。

圖1（a）為CHO-K1細胞在種子鏈階段的生長狀況。添加ACA的實驗組細胞密度明顯高于不添加ACA對照組。如表1所示，添加ACA實驗組細胞倍增時間變化較小，隨著細胞恢復和傳代次數的增加，細胞倍增時間也在縮短，從復蘇代P1的24.80 h縮短至P5的21.90 h。在沒有添加ACA的對照組中，細胞倍增時間變化較為明顯，隨著細胞恢復和傳代次數的增加，細胞倍增時間大體上也在縮短，從復蘇代P1的33.64 h縮短至P5的22.47 h。隨培養時間和傳代次數的增加，兩個組別差距在縮小，但添加ACA組的生長仍然優于不添加組。

圖1 種子鏈細胞密度及活率

表1 種子鏈細胞倍增時間（單位：h）

圖1（b）為CHO-S細胞在種子鏈階段的生長狀況。在不添加ACA培養的搖瓶中，通氣攪拌以及pH等無法精確控制，加之CHO-S細胞本身的結團特性，培養中不添加ACA的對照組細胞有肉眼可見的細胞碎片，且細胞生長密度明顯較低，細胞活率略低。由表1可知，不添加ACA組的倍增時間相對于添加ACA的實驗組明顯較長。對于添加ACA細胞，從復蘇開始，倍增時間變化較小，隨著細胞恢復和傳代次數的增加，細胞倍增時間也在縮短，從復蘇代P1的21.86 h縮短至P5的17.46 h。在沒有添加ACA的培養組中，細胞倍增時間變化較為明顯，隨著細胞恢復和傳代次數的增加，細胞倍增時間明顯縮短，從復蘇代P1的39.34 h縮短至P5的20.68 h。種子鏈階段添加ACA能明顯改善CHO-S細胞的生長狀態，使其處于較優的培養環境中。

對CHO-S和CHO-K1細胞的倍增時間做t檢驗分析，發現CHO-S細胞種子鏈兩個組細胞有顯著差異（P＜0.05）；CHO-K1細胞種子鏈兩個組細胞在t檢驗分析中雖有差異，但不顯著。在工藝開發過程中，種子鏈階段細胞的生長狀況直接影響細胞種子鏈擴增的代數和培養周期，也會間接影響流加階段細胞的穩定代謝，而ACA的添加對種子鏈細胞培養有積極作用。

2.2 流加階段

2.2.1 流加階段細胞生長及代謝

流加培養能夠調節培養環境中的營養物質濃度，避免有些營養成分在初始階段濃度過高而影響細胞的生長代謝以及產物的形成，也能防止某些限制性營養成分在細胞培養的過程中被耗盡而影響細胞的生長代謝以及產物的形成。本實驗采用種子鏈添加ACA的實驗組細胞進行流加培養階段接種。流加培養在細胞進入對數期開始對細胞進行流加補料培養，控制葡萄糖濃度在0.5～7.0 g/L。

圖2為CHO-K1細胞在流加培養階段細胞生長和代謝狀況。兩個組別細胞均在第2天進入對數生長期，細胞快速生長。在第5～7天處于平臺期，細胞密度及活率處于一個穩定的狀態。第8天開始，由于培養環境中營養成分、細胞代謝廢物以及培養時間的影響，細胞活率和活細胞密度開始下降。整個培養過程中，pH維持在無控制作用區（6.95±0.25），乳酸呈現先上升后下降的趨勢。生長代謝方面，兩個組別細胞表現出高度的一致性。

圖2 CHO-K1細胞流加培養生長代謝

如圖3所示，CHO-S細胞在流加培養階段添加ACA，代謝出現異常，在培養至第6天時，細胞活率明顯下降，乳酸代謝從消耗轉為再次生產，并不斷累積，導致細胞培養液pH下降，滲透壓上升。流加階段未添加ACA組細胞生長正常，培養至第14天時收獲。整個培養過程中滲透壓隨培養時間和補料的添加逐漸增加，乳酸呈現先生成再下降最后有再次生成的趨勢，收獲時乳酸為1.05 g/L，在可接受范圍內；pH在無控制作用區（6.95±0.25）。

圖3 CHO-S細胞流加培養生長代謝

2.2.2 流加階段細胞產物生成

生物反應器中進行細胞流加培養，控制溶氧在40%、攪拌速度為265 r/min、pH無控制作用區為6.95±0.25以及0.1 m3/（m3·min）的恒定通氣速率。培養過程中，監測細胞的生長代謝狀況，定量流加補料，以滿足細胞生長的營養需求[7]。

表2為流加培養結束時蛋白的表達量、單個細胞的蛋白比生產速率和累計活細胞密度。在CHO-K1細胞中，兩個組別的蛋白表達量均大于7 g/L，且相差不大。單個細胞產蛋白的能力接近，Qp均在29 pg/（個·d）。兩個組別細胞活細胞密度生長趨勢具有一致性，累計活細胞密度差異不大。由于表達系統的區別，添加ACA的CHO-S細胞代謝異常，終止培養；沒有添加ACA組的細胞最終蛋白產量為3.20 g/L，Qp為12.76 pg/（個·d），能夠滿足工藝要求。

表2 流加培養蛋白表達和累計活細胞密度

2.2.3 細胞培養產物質量

抗體類藥物屬于結構復雜的生物大分子，在細胞培養、分離純化以及保存運輸等過程中容易發生不均一性變化，如C末端氨基酸發生突變，形成二聚體和多聚體等結構變異，而這些變異會嚴重影響藥物的臨床效果和安全性能。而在流加培養中，有毒物質和代謝廢物的積累對目的蛋白的質量有不利影響[8]。本實驗中主要通過SEC-HPLC、iCIEF、CE-SDS分析檢測蛋白的質量，其中SEC-HPLC和CE-SDS都是分析產品純度和雜質的重要方法，SEC-HPLC側重聚體分析，CE-SDS側重片段分析。iCIEF主要用于分析產品的等電點和電荷異質性。而細胞培養工藝條件對抗體異質性的影響非常顯著[9]。

由表3可知，在CHO-K1細胞中，兩個組別SEC單體純度均大于97%、iCIEF主峰均大于73%、CE-SDS主峰大于92%，添加ACA對蛋白的關鍵質量沒有明顯的影響，兩個組別蛋白質量高度一致。在CHO-S細胞中，iCIEF主峰較低，堿性峰較大，這是由于CHO-S表達系統，C端賴氨酸變體的存在。

表3 細胞流加培養蛋白質量

3 結論

抗結團劑的添加可以改變細胞表面的電荷，使細胞呈現單細胞狀態，從而改善細胞的生存微環境。CHO-K1和CHO-S細胞在種子鏈階段添加ACA均能改善種子細胞狀態，促進種子生長速度，縮短其倍增時間。對于CHO-K1細胞，添加和不添加ACA組在細胞生長、細胞代謝、蛋白表達量以及質量方面均沒有明顯差異。CHO-S細胞流加培養階段添加ACA會出現代謝異常，如乳酸異常堆積、pH下降、細胞活率迅速下降，因此提前終止培養；CHO-S細胞流加培養階段不添加ACA時，細胞生長、細胞代謝、蛋白表達量及蛋白質量均正常，符合預期。結合細胞培養代謝的穩定性、工藝的復雜度以及后續放大成本考慮[10-11]，CHO-K1和CHO-S細胞培養中，只需在其種子鏈擴種期間添加ACA以改善種子生長狀態。