高溫水氨解快速提取人發角蛋白

郭克兵，田湞楨，付艷紅，嚴琬瑩，季金茍

（重慶大學 化學化工學院，重慶 401331）

人發、羊毛、兔毛、雞毛等角蛋白含量豐富，是開發嚴重不足的蛋白質來源之一。近年來，隨著對角蛋白在生物醫學領域的研究深入，人們發現不同種屬動物來源的角蛋白由于組分的區別，可以產生不同的生物學效應[1]。其中，人發角蛋白由于其是人源性的，具有免疫學方面的優勢[2]，在植入材料方面具有極大的應用潛力，受到了越來越多的關注。

將人發、羊毛等天然角蛋白材料解聚為線性角蛋白大分子，是制備再生角蛋白材料的前提[3]。人發中的角蛋白是以α-螺旋為主要結構的α-角蛋白，是由氫鍵、離子鍵、疏水鍵、范德華力和二硫鍵來穩定結構的水不溶性大分子[4-6]，難以提取，如何從人發中高效提取并純化角蛋白是當前學者們普遍關注的問題。目前從人發中提取角蛋白的方法有兩種，一種是“Shindai法”，另一種是“還原法”[7-8]。這兩種方法均使用有毒的β-巰基乙醇，且提取時間較長。房啟海等[9]用熔融尿素法對羊毛角蛋白進行了提取，提取時間在50 min左右，作者認為熔融尿素法之所以可以較快地對羊毛角蛋白進行提取，是高溫下尿素分解產生氨氣，進入角蛋白結晶區，破壞羊毛角蛋白之間的氫鍵。

高溫水通常是指溫度在100 ℃到臨界點附近，以及超臨界狀態時的壓縮水。隨著溫度升高，高溫水密度減小，氫鍵變弱，物質的溶解度增大，這有利于反應物處于同一反應相中，降低反應活化能，提高反應速率[10-11]。因此，本文擬利用高溫水能增大物質的溶解度，且氨氣有助于破壞角蛋白之間的氫鍵等原理提取人發角蛋白，以期得到一種提取時間短、對蛋白質破壞小的提取方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人發，搜集于理發店；聚氧乙烯辛基苯酚醚-10（OP-10），成都科龍化工試劑廠；氫氧化鈉、23%氨水、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris），重慶川東化工有限公司；碳酸氫鈉，成都市科隆化學品有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），美國Sigma公司；考馬斯亮藍R250、過硫酸銨，上海生工生物工程股份有限公司；醋酸，國藥集團化學試劑有限公司。以上所有試劑均為分析純。蛋白上樣緩沖液、彩色預染Marker（11～180 kD），生物試劑，上海源葉生物科技有限公司。實驗用水為實驗室自制去離子水。

GFK-10-200型水熱合成反應釜，上海貝倫儀器設備有限公司；DHG-9033A型電熱恒溫鼓風干燥箱，沙鷹科學儀器有限公司；MD1444（8 000～14 000 Da）型透析袋，上海源葉生物科技有限公司；GL-21M型高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；FD-IA-50型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器；Nicolet iS50型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher公司；1658001型電泳儀設備，美國Bio-Rad公司；PANalytical X’Pert Powder X射線衍射儀，Spectris公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人發預處理

按文獻[6,12]的方法，稱取一定量人發，剪至0.5～1.0 cm，按1∶2∶2（g∶mL∶mL）的比例向燒杯中依次加入人發、4% OP-10和5% NaOH，使人發浸沒于溶液中，室溫下攪拌2 h。用去離子水沖洗6次，將其置于60 ℃烘箱過夜干燥，保存待用。

1.2.2 高溫水氨解

稱取2.0 g已預處理的人發，置于200 mL水熱合成反應釜內膽，加入氨水，攪拌均勻，將反應釜放入烘箱，在一定溫度下反應一段時間。高溫水氨解結束后，在人發反應液中加入50 mL去離子水，室溫下攪拌1.5 h，用四號篩網過濾，收集濾液，濾渣干燥稱重。按照式（1）計算人發角蛋白溶解率（S）：

式中，m0為反應前的人發重量，g；m1為水提取后的干燥濾渣重量，g。

單因素條件優化設置如下。（1）溫度：氨水用量10 mL，反應時間30 min，反應溫度分別設置為175 ℃、180 ℃、185 ℃和190 ℃。（2）氨水用量：反應溫度185 ℃，反應時間30 min，選擇氨水添加量分別為6 mL、8 mL、10 mL和12 mL。（3）時間：反應溫度185℃，氨水用量8 mL，考察反應27 min、30 min、33 min和36 min對實驗結果的影響。

1.2.3 透析

將收集的濾液調至pH=7.4，靜置后在4 ℃下12 000×g離心20 min，合并上清液。上清液調pH至4.0～4.2，在4 ℃下6 000×g離心20 min。取角蛋白沉淀分散于1 mol/L碳酸氫鈉中，放入透析袋（截留分子量3 500 Da）中透析36 h，透析外液為去離子水，每12 h更換一次透析外液。冷凍干燥，得淺黃色粉末。按照式（2）計算人發角蛋白產率（P）：

式中，m0為反應前的人發重量，g；m2為凍干后角蛋白粉末的重量，g。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

參照RAMYA等[13]方法并稍作修改。配置12%的分離膠：1.6 mL去離子水、2 mL丙烯酰胺溶液（30%）、1.3 mL的 Tris（pH 8.8，1.5 mol/L）、0.05 mL的SDS溶液（10%）、0.05 mL過硫酸銨（10%）和0.002 mL四甲基乙二胺。5%濃縮膠：2.1 mL去離子水、0.5 mL丙烯酰胺混合溶液（30%）、0.38 mL的Tris（pH 6.8，1.0 mol/L）、0.03 mL的SDS溶液（10%）、0.03 mL過硫酸銨（10%）和0.003 mL四甲基乙二胺。

取20 μL角蛋白樣品（15 mg/mL）加入5×上樣緩沖液，煮沸10 min。取煮沸冷卻后的樣品10 μL和Marker 5 μL，上樣。80 V電壓下進行電泳，待Marker條帶出現后，增大電壓至110 V，直至電泳分離結束。考馬斯亮藍R250染色，乙醇-醋酸脫色至無背景色。

1.2.5 傅里葉紅外光譜（FT-IR）

將溴化鉀在紅外燈下于研缽中研磨成均勻粉末，再將角蛋白樣品與溴化鉀以1∶100的比例混合均勻后，研磨成粉。壓片機20 MPa壓制1～2 min成透明薄片，用FT-IR在4 000～400 cm-1掃描。

1.2.6 粉末X射線衍射（XRD）

取適量角蛋白樣品，研磨成細粉，過200目篩，進行粉末X射線衍射測試。

1.3 數據處理

使用GraphPad軟件（Insight Science公司）進行統計分析。顯著性水平設為α=0.05；用最小顯著性差異法檢驗數據間的差異顯著性，用P＜0.05表示。

2 結果與分析

2.1 高溫水氨解條件的優化

2.1.1 溫度

從圖1可以看出，溫度從175 ℃升高到185 ℃，角蛋白溶解率和產率均逐漸增加；溫度升高到190 ℃時溶解率繼續增大，但產率反而減少。正常人的毛發主要由表皮層、皮質層和髓質層組成[14]。表皮存在6～12層毛鱗片，像魚鱗一樣硬質透明；皮質層由蛋白細胞和色素細胞組成，占頭發的80%左右，是頭發的主體。當溫度較低時，毛鱗片對抗氨解能力較強，所以在175 ℃時，角蛋白溶解率和產率都較小，升高溫度使角蛋白溶解率和產率增大，但當溫度超過185 ℃時，角蛋白被進一步降解成小分子量蛋白，從而穿過透析袋進入透析外液，使產率降低。

圖1 溫度對溶解率和產率的影響

從圖2可以看出，175～185 ℃時分子量主要分布在25 kDa以下、35～48 kDa、75～135 kDa；190 ℃時凝膠色帶不明顯。可見在高溫氨解體系中，溫度控制在185 ℃較為適宜。

圖2 溫度對分子量分布影響

2.1.2 氨水用量

從圖3可以看出，氨水用量為8 mL時產率相對最大。角蛋白產率先增加后下降，是由于隨著氨水用量增加，反應釜內壓力增加，氨氣和高溫水的各種理化性質均發生了相應的改變，有利于角蛋白提取率增加，但壓力過大可能使角蛋白的分子鏈降解速率加快，使角蛋白的提取率下降，故氨水用量控制在8 mL比較適宜。從圖4可以看出，分子量主要分布于25 kDa以下、35～48 kDa、75～135 kDa。

圖3 氨水用量對溶解率和產率的影響

圖4 氨水用量對分子量分布影響

2.1.3 時間

從圖5可以看出，隨著時間的增加，溶解率逐漸增加，產率先增加后下降，至33 min時產率最高，可能是時間過長導致降解過度。從圖6可以看出，盡管降解33 min時產率最高，但其分子量主要分布在25 kDa以下，角蛋白的結構被破壞較大，降解30 min時，角蛋白分子量主要分布在25 kDa以下、35～48 kDa、75～135 kDa，產率為28.33%。一般認為高分子量的角蛋白在制備現代生物材料過程中具有顯著優勢[3]，因此氨解30 min較適宜。

圖5 時間對溶解率和產率的影響

圖6 時間對分子量分布影響

2.2 角蛋白的FT-IR分析

從圖7可以看出，天然人發纖維與提取的人發角蛋白均具有3 200～3 400 cm-1肽鍵酰胺A帶，1 638～1 657 cm-1的酰胺I帶，1 534～1 545 cm-1的酰胺Ⅱ帶和1 240～1 245 cm-1的酰胺Ⅲ帶，說明兩者均具有典型的蛋白質結構[15-16]，提取所得角蛋白與天然人發纖維分子結構相同。

圖7 人發纖維（a）與角蛋白提取物（b）的紅外譜圖

人發纖維在2 364 cm-1左右沒有明顯的巰基吸收峰，而在提取的人發角蛋白出現此吸收峰，表示反應后巰基增多；和天然人發纖維相比，提取的人發角蛋白中酰胺A帶從3 285 cm-1紅移到3 365 cm-1，且吸收程度增大、譜帶變寬，推測是高溫產生的氨氣進入角蛋白結晶區，破壞酰胺氫鍵所致[9]；另外，高溫和氨水的堿性也易使二硫鍵、酰胺氫鍵等斷裂或減弱，使A帶吸收程度增大、譜帶變寬。在提取的人發角蛋白中，酰胺I帶和酰胺Ⅱ帶的吸收強度相差較大，根據峰的歸屬可知，酰胺I帶為νC=O伸縮振動，酰胺Ⅱ帶為νN-H伸縮振動及δN-H彎曲振動，因為C=O鍵和N-H鍵都受角蛋白中的酰胺氫鍵嚴重影響，可見，高溫氨解對νC=O伸縮振動的吸收程度影響更大。反應前后的峰圖中沒有明顯雜峰，可初步判斷提取過程中基本未引入雜質。

2.3 角蛋白的XRD分析

圖8為角蛋白提取物和人發纖維的XRD圖譜。角蛋白在9°和20°左右存在兩個特征峰，9°的峰（結晶Ⅰ區）歸屬于α-螺旋和β-折疊，20°左右的峰（結晶Ⅱ區）則歸屬于β-折疊[17]。與人發纖維相比，角蛋白提取物9°的峰不明顯，20°左右對應的峰弱化，表明晶體化程度降低，提取過程破壞了角蛋白二級結構中部分α-螺旋和β-折疊。

圖8 人發纖維（a）與角蛋白提取物（b）的X射線衍射圖

3 結論

本文采用高溫水氨解的方法對人發角蛋白進行了提取，結果表明，在185 ℃、8 mL氨水、降解30 min條件下，可獲得分子量分布在25 kDa以下、35～48 kDa和75～135 kDa的角蛋白，分子量破壞較小。XRD顯示，所得角蛋白晶體化程度降低，提取過程破壞了人發角蛋白二級結構中的α-螺旋和β-折疊；FT-IR可以看出，提取所得角蛋白具有典型的蛋白質結構，且與天然人發纖維分子結構相同，提取時氨氣進入角蛋白結晶區，破壞酰胺氫鍵，二硫鍵斷裂或減弱，使提取時間大大加快。研究表明，高溫水氨解是一種快速提取人發角蛋白的較好方法。