吳靜

（江西省科學院應用化學研究所，江西南昌 330096）

龍腦樟[Cinnamomum camphora(L.) Presl]為樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum）常綠喬木，1987年首次在江西吉安發現，目前在江西吉安、湖南新晃兩地有種植，資源較為稀缺[1]。因其精油中富含右旋龍腦（天然冰片），在中醫典籍中將其劃分為芳香開竅類藥材，常用于通竅明目、解郁散火、祛風和中[2-8]?，F代醫學研究發現冰片具有抗炎鎮痛、抗菌、增加血-腦脊液屏障及血腦屏障通透性、抗腦缺血、雙向調節神經系統等功能[9]，因此常用于冠心病、動脈粥樣硬化及心血管阻塞等心血管疾病的治療。此外，研究表明龍腦樟中含有苯丙素類、萜類及黃酮類化合物等活性成分[10]。黃酮類化合物不能在人體內直接合成，廣泛存在于自然界的植物中，屬于植物的次生代謝產物，是一種天然的活性成分，具有抗菌殺蟲、延緩衰老、緩解動脈粥樣硬化、降血脂、降血壓等功能[11-13]。本文針對龍腦樟黃酮類物質的提取工藝進行研究，為進一步提高龍腦樟資源的整體利用率提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標準品，純度≥98%，上海盈元化工有限公司；氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇，分析純，天津市致遠化學試劑股份有限公司。

龍腦樟由江西樟鄉天然冰片有限責任公司提供，經江西省科學院應用化學研究所李雄輝研究員鑒定為龍腦樟，樣本編號為PML202102。

1.2 儀器

2500A多功能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司；KQ-500DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DLSB-10L/10低溫冷卻液循環泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；Infinite 200 PRO酶標儀，瑞士TECAN公司；ME204E電子天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線繪制

準確稱取蘆丁標準品，用無水乙醇溶解，將蘆丁標準品配置成濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL和2.0 mg/mL的蘆丁標準液。取蘆丁標準液1 mL于比色管中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，避光反應5 min，之后依次加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液、2 mL 4%氫氧化鈉溶液，靜置反應15 min。于510 nm處測定吸光度，得到蘆丁標準曲線。

1.3.2 龍腦樟黃酮提取

1.3.2.1 工藝流程

黃酮提取流程為樣品→干燥粉碎（過20目篩）→石油醚脫脂→回收石油醚→乙醇超聲提取→抽濾→濃縮→定容→龍腦樟黃酮提取液。

1.3.2.2 提取方法

準確稱取1.00 g龍腦樟粉末，按1∶20（g∶mL）加入石油醚（60～90 ℃沸程），于50 ℃超聲提取2次，超聲功率500 W，每次30 min，去上清液。殘渣于60 ℃烘箱中烘干。按照一定液料比加入乙醇溶液，超聲波提取，重復提取3次，抽濾，合并濾液，真空減壓濃縮，回收乙醇，定容至50 mL，獲得龍腦樟黃酮提取原液。參照標準品顯色方法，每組重復3次。按照公式（1）計算總黃酮提取量：

式中，P為待測樣品黃酮提取量（以蘆丁計），mg/g；C為代入標準曲線后得到的提取物樣液的黃酮濃度，mg/mL；V為提取物樣液體積，mL；N為稀釋倍數；m為待測樣品質量，g。

1.3.3 單因素實驗

稱取1.00 g干燥至恒重的龍腦樟粉末，分別考察乙醇體積分數、提取時間、溶劑量和提取溫度對總黃酮提取量的影響。按方法1.3.2.2測其黃酮提取量，每組平行提取3次，獲得各條件下最佳提取工藝條件。

（1）乙醇體積分數。固定溶劑量為20 mL/g，提取溫度為50 ℃，提取時間為30 min，考察乙醇體積分數分別為30%、40%、50%、60%和70%對樣品黃酮提取量的影響。

（2）提取時間。固定溶劑量為20 mL/g，提取溫度為50 ℃，乙醇體積分數為50%，考察提取時間分別為10 min、15 min、20 min、25 min和30 min對樣品黃酮提取量的影響。

（3）溶劑量。固定提取溫度為50 ℃，乙醇體積分數為50%，提取時間為30 min，考察溶劑量分別為10 mL/g、20 mL/g、30 mL/g、40 mL/g 和 50 mL/g 對樣品黃酮提取量的影響。

（4）提取溫度。固定溶劑量為20 mL/g，提取時間為30 min，乙醇體積分數為50%，考察提取溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃對樣品黃酮提取量的影響。

1.3.4 響應面實驗設計

依據單因素實驗確定的最佳工藝條件，針對（A）提取溫度、（B）提取時間、（C）溶劑量和（D）乙醇體積分數，設計4因素3水平實驗，見表1。以黃酮提取量為響應值，通過數據分析獲取最佳提取工藝條件。

表1 Box-Behnken實驗設計的因素與水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

以蘆丁濃度（X）和吸光度（Y）繪制標準曲線，回歸方程為Y=1.827 5X+0.311 1（R2=0.996 4），在0.06～0.60 mg/mL內線性關系良好。

2.2 單因素實驗

2.2.1 溶劑量

如圖1所示，龍腦樟黃酮提取量隨著溶劑體積增加呈上升趨勢，這說明溶劑較多時，龍腦樟粉末與溶劑充分接觸，在超聲波輔助作用下黃酮類物質充分轉移至溶劑。而溶劑量達到40 mL/g后，溶劑繼續增加會使溶液中黃酮類物質含量下降，這可能是因為溶劑已經飽和，同時溶劑過多會使油脂類、糖類等黏性物質滲出，進一步影響溶液吸光度[14-15]。因此，確定40 mL/g為最佳溶劑量。

圖1 不同溶劑量對黃酮提取量的影響

2.2.2 乙醇體積分數

如圖2所示，龍腦樟黃酮提取量在乙醇體積分數不超過60%時隨著乙醇體積分數的增大而增加，這可能是因為黃酮類化合物易溶于強極性溶劑。乙醇體積分數超過60%時，總黃酮提取量減小，可能是乙醇體積分數過高，使龍腦樟中色素、脂溶性物質等滲出，黃酮類化合物溶解度降低[16]。因此，最佳乙醇體積分數為60%。

圖2 乙醇體積分數對黃酮提取量的影響

2.2.3 超聲時間

由圖3可知，龍腦樟黃酮提取量在超聲時間10～20 min內隨時間延長呈上升趨勢，主要是因為超聲波的機械振動、擊碎和攪拌等功能，物質分子運動加快，細胞壁破裂，黃酮類物質與溶劑充分接觸并溶解。超聲時間超過20 min后，龍腦樟黃酮含量開始出現下降趨勢，這主要是由于超聲時間過長，植物細胞破碎，溶液黏度增加，擴散速率降低，影響黃酮類物質提取，同時超聲處理時間延長使黃酮類化合物穩定性降低，黃酮類物質結構被破壞、分解[17]。因此，20 min為最佳超聲時間。

圖3 不同提取時間對黃酮提取量的影響

2.2.4 提取溫度

如圖4所示，提取溫度30～50 ℃，總黃酮提取量隨溫度升高而增加，是因為溫度升高導致分子熱運動速度加快，黃酮類物質快速溶于溶劑中。提取溫度達到50 ℃時，龍腦樟黃酮類化合物幾乎完全浸出，溶劑達到飽和狀態，溫度繼續升高無法溶解出更多黃酮類化合物；同時高溫會破壞黃酮類物質的結構與穩定性，伴有大量的雜質溶出，黃酮提取量下降。因此，最佳提取溫度為50 ℃。

圖4 不同提取溫度對黃酮提取量的影響

2.3 響應面實驗

2.3.1 建立多元二次模型方程

4因素3水平Box-Behnken實驗數據見表2。經數據分析，得到以龍腦樟黃酮提取量為響應值的多元回歸方程（2）：

表2 Box-Behnken實驗設計和數據結果

式中，Y為總黃酮含量，mg/g；A為提取溫度，℃；B為超聲時間，min；C為溶劑量，mL/g；D為乙醇體積分數，%。

模型方差分析結果見表3，模型P=0.019 8＜0.05，表明該實驗方法的實驗結果可信；失擬項P=0.872 2＞0.05，表明可用該數學模型推測試驗結果；R2adj=0.918 6表明有91.86%的情況可以用此方程解釋。A、AB、BD和A2對黃酮提取量的影響顯著（P＜0.05），D和D2對黃酮提取量的影響極顯著（P＜0.01），而B、C、AC、AD、BC、CD、B2和C2的影響不顯著（P＞0.05）。

表3 回歸方程模型的方差分析

2.3.2 響應面交互作用分析

如圖6所示，提取溫度和超聲時間的交互作用顯著。將溶劑量和乙醇體積分數固定在0水平，提取溫度不斷升高，黃酮提取量呈現先增加后減少趨勢，當提取溫度達到57 ℃時，黃酮提取量達到最高。而對于超聲時間，分三段討論：提取溫度在40～50 ℃時，超聲時間越長，黃酮提取量越高；提取溫度在50～55 ℃時，超聲時間延長，黃酮提取量先增加后減少；提取溫度在55～60 ℃時，超聲時間越長，黃酮提取量減小。

圖6 提取溫度和超聲時間交互作用對黃酮提取量的影響

由圖7可知，提取溫度和溶劑量交互作用對龍腦樟黃酮提取量的影響不顯著。將超聲時間和乙醇體積分數固定在0水平，黃酮提取量隨溫度的升高先增大后減小，黃酮提取量最大時，提取溫度為54 ℃。隨著單位物料加入溶劑體積的增加，黃酮提取量先增加后減小，溶劑體積達到45 mL/g時，龍腦樟黃酮提取量最大。

圖7 提取溫度和溶劑量交互作用對黃酮提取量的影響

如圖8所示，提取溫度與乙醇體積分數交互作用對黃酮提取量的影響不顯著。將超聲時間和溶劑量固定在0水平，提取溫度升高，龍腦樟黃酮提取量先增加后減小，提取溫度54 ℃時，黃酮提取量達到最高值。乙醇體積分數增加，黃酮提取量呈現先增加后減小趨勢，乙醇體積分數達到58%時，黃酮提取量最大。

圖8 提取溫度和乙醇體積分數交互作用對黃酮提取量的影響

觀察圖9可知，超聲時間與溶劑量交互作用對黃酮提取量影響不顯著。將提取溫度和乙醇體積分數定在0水平，可以得出，隨著超聲時間的延長和溶劑量的增加，黃酮提取量均表現為先增加后減小的趨勢。超聲時間為21 min，溶劑量為41 mL/g，黃酮提取量最大。

圖9 超聲時間和溶劑量交互作用對黃酮提取量的影響

由圖10可知，超聲時間和溶劑量對黃酮提取量影響顯著。當提取溫度和溶劑量處在0水平時，乙醇體積分數在50%～53%，隨著超聲時間延長，龍腦樟黃酮提取量不斷減小；而乙醇體積分數在62%～70%，隨著超聲時間延長，黃酮提取量先增大后減小。超聲時間在15～19 min，乙醇體積分數越大，黃酮提取量先增大后減??；超聲時間在19～35 min，龍腦樟黃酮提取量隨乙醇體積分數增大而不斷減小。

圖10 超聲時間和乙醇體積分數交互作用對黃酮提取量的影響

如圖11所示，溶劑量與乙醇體積分數的交互作用對黃酮提取量的影響不顯著。將提取溫度和超聲時間固定在0水平，隨著溶劑量的不斷增大，龍腦樟黃酮提取量先增大后減小，當黃酮提取量最大時，溶劑量為42 mL/g。乙醇體積分數不斷增大，黃酮提取量也呈先增大后減小趨勢，黃酮提取量最大時，乙醇體積分數為58%。

圖11 溶劑量和乙醇體積分數交互作用對黃酮提取量的影響

綜合圖6～圖11結果可知，提取溫度與超聲提取時間，超聲提取時間與乙醇體積分數的交互作用對龍腦樟黃酮提取量影響顯著，觀察曲面圖的陡峭程度并結合P值，4個因素對龍腦樟黃酮提取量的影響順序為乙醇體積分數＞提取溫度＞溶劑量＞超聲時間。

2.3.3 回歸模型驗證

綜上所述，得出的最佳提取條件為提取溫度60.00 ℃，超聲提取時間15.00 min，溶劑量45.84 mL/g，乙醇體積分數50.03%。設計驗證實驗的條件為乙醇體積分數50%，溶劑量46 mL/g，超聲提取時間15 min，提取溫度60 ℃，重復提取3次，黃酮提取量分別為160.82 mg/g、161.23 mg/g、160.75 mg/g， 均 值 為160.93 mg/g。系統得出的理論值為161.86 mg/g，實驗值接近理論值，該模型可較好地預測龍腦樟黃酮類物質的提取情況。

3 結論

本研究以乙醇為溶劑，采用響應面法優化超聲提取龍腦樟黃酮工藝。龍腦樟黃酮最優提取條件為提取溫度60 ℃、超聲提取時間15 min、溶劑量46 mL/g、乙醇體積分數50%，預測黃酮提取量為161.86 mg/g。經實驗驗證，得出的實際黃酮提取量平均值為160.93 mg/g，與預測值相符，表明該提取條件可行。本研究可為龍腦樟黃酮類物質的開發利用提供理論支持，進一步提高龍腦樟的綜合利用價值。