油茶果殼多糖的提取工藝及免疫活性研究

林欣穎，謝傳奇

（1.江西省科學院應用化學研究所，江西南昌，330096；2.廈門大學 醫學院，福建廈門 361104）

油茶（Camellia oleiferaAbel），屬于山茶科、山茶屬小喬木，被當作我國重點發展的第一大木本油料作物，擁有相當悠久的種植歷史，與油棕、油橄欖和椰子共稱世界四大木本食用油料植物[1]。油茶在榨油的過程中會產生大量廢棄物，其中油茶果殼是主要的榨油剩余物之一，其質量超過了油茶果全部質量的60%[2]，因此其儲量非常豐富。但是目前油茶果殼主要還是被人們當作沒有用的垃圾直接丟掉或者焚燒，沒有得到高值化利用[3]。對油茶果殼這種非木質化資源進行研究開發，不僅能節約資源，還能在一定程度上保護生態環境，產生一定的經濟效益。

多糖是一類天然高分子化合物，在生物界中廣泛存在，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖和降血脂等多種藥理活性。研究表明，油茶果殼含有豐富的多糖[4-5]，基于此，本研究采用響應面法對油茶果殼多糖的提取工藝進行優化，并通過細胞實驗對其免疫活性進行初步評價，以期為油茶果殼資源的開發利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶果殼，江西省恩泉油脂有限公司。

葡萄糖、苯酚，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸，分析純，天津致遠化學試劑有限公司；DMEM高糖培養基（貨號SH30604.01），美國HyClone公司；胎牛血清（批號NTC-HK026），阿根廷Natocor工業；青鏈霉素（貨號B540732）、PBS（貨號E607008）、胰蛋白酶（貨號A003702）、臺盼藍（貨號A601140）、MTT（貨號A100793），上海生工生物工程股份有限公司；亞硝酸鈉，分析純，上海凜恩科技發展有限公司；LPS（貨號L8880）、DMSO（貨號D8371），北京索萊寶科技有限公司；對氨基苯磺酸、醋酸、α-萘胺，均為分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

運邦2500A多功能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司；B-260恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；Infinite 200 PRO酶標儀，瑞士TECAN公司；ME204E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Cell Mate二氧化碳培養箱，新加坡Esco公司；ECLIPSE Ts2倒置顯微鏡，日本NIKON公司；TD50002A電子天平，上海衡際科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 油茶果殼多糖的提取

將油茶果殼粉碎，過60目篩，置于錐形瓶中，按照一定的提取溫度、提取時間和料液比進行浸提，提取溫度選擇60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃5個水平；提取時間選擇20 min、40 min、60 min、80 min和100 min5個水平；料液比選擇1∶10（g∶mL）、1∶20（g∶mL）、1∶30（g∶mL）、1∶40（g∶mL）和1∶50（g∶mL）5個水平。采用控制變量法分別進行單因素實驗，考察溫度變量時，提取時間為60 min、料液比為1∶30（g∶mL）；考察提取時間變量時，溫度為80 ℃、料液比為1∶30（g∶mL）；考察料液比變量時，溫度為80 ℃、提取時間為60 min。隨后抽濾，取上清液，再經過80%乙醇醇沉，25%活性炭脫色初步純化，即得到油茶果殼粗多糖。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的繪制

精準稱取0.01 g干燥至恒重的無水葡萄糖，將其配制成濃度為1 mg/mL的標準溶液，繼而依次將其稀釋為 400.00 μg/mL、200.00 μg/mL、100.00 μg/mL、50.00 μg/mL、25.00 μg/mL、12.50 μg/mL 以 及6.25 μg/mL的標準溶液。經過適當調整，取標準溶液0.2 mL于離心管中，加入0.1 mL 5%的苯酚溶液，充分混勻，再加入0.5 mL硫酸混勻后將其放置于40 ℃水浴30 min，以流動水冷卻至室溫，使用酶標儀于490 nm波長處測定其吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，建立葡萄糖標準曲線。得到葡萄糖標準品濃度（xmg/mL）與吸光度y的回歸方程：y=10.534x+0.202 8，R2=0.994 2。

1.3.3 多糖含量的測定

精密移取0.2 mL上清液于離心管中，加入0.1 mL 5%的苯酚溶液，混合均勻，加入0.5 mL硫酸再次混勻后置于40 ℃水浴30 min，流水冷卻直至室溫，于490 nm波長處測定其吸光度。根據葡萄糖標準曲線計算出總多糖濃度，再按公式（1）計算出總多糖含量。

式中：P為待測樣品中的總多糖含量，mg/g；C為代入葡萄糖標準曲線后所得的提取物樣液的總多糖濃度，mg/mL；V為提取物樣液的體積，mL；N為稀釋倍數；M為待測樣品質量，g。

1.3.4 響應面優化實驗設計

使用Design-Expert 8.0軟件，在得到了單因素實驗結果的基礎上，通過Box-Behnken對提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）3個因素進行試驗，通過數據分析優化油茶果殼多糖提取工藝。因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計的因素與水平

1.3.5 Griess實驗

用PBS將亞硝酸鈉稀釋成系列濃度1.563 μmol/L、3.125 μmol/L、6.250 μmol/L、12.500 μmol/L、25.000 μmol/L、50.000 μmol/L 和 100.000 μmol/L，每個濃度設置2個平行，每個孔加100 μL對應濃度的亞硝酸鈉。然后每個孔再加100 μL配制好的Griess試劑，室溫振蕩10 min，使用酶標儀于540 nm處測吸光度，得到線性方程y=0.005 3x-0.003 4，R2=0.999 7，其中x為NO濃度（μmol/L），y為吸光度。

分別設置空白組、對照組、LPS陽性對照組以及藥物組。取處于對數生長期的RAW264.7細胞進行細胞計數，將密度調整為5×105個/mL并于96孔板中接種，100 μL/孔，空白組加無血清培養液100 μL/孔，邊緣均填充 PBS，200 μL/孔，37 ℃培養箱中培養過夜。用無血清培養液配制多糖樣品濃 度 分 別 為 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL 和 1 600 μg/mL備用；LPS配制為2 μg/mL。空白組、對照組加無血清培養液100 μL/孔，LPS組加100 μL 2 μg/mL的LPS溶液，藥物組分別加100 μL不同濃度的多糖樣品，37 ℃孵育24 h。小心轉移100 μL上清液至一個新的96孔板中，并加入100 μL配制好的Griess試劑，在室溫下振蕩10 min，于540 nm處測定吸光度，將其代入上述線性方程式中即可獲得NO的濃度。

1.3.6 MTT實驗

如1.3.5處理細胞，吸走上清后，每孔加入10 μL MTT溶液，避光，37 ℃孵育4 h。小心吸走上清液，加入DMSO 150 μL/孔，室溫振蕩10 min，于492 nm處測定其吸光度，并按公式（2）計算細胞存活率。

1.4 數據分析

所有實驗均重復3次，實驗結果以平均值±標準差（±s）表示，響應面實驗選用Design expert 8.0軟件進行數據分析。細胞實驗結果采用GraphPad Prism 8進行數據統計和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 提取溫度對總多糖含量的影響

如圖1所示，提取溫度在60～90 ℃時，總多糖含量隨著提取溫度的升高而增大，90 ℃時總多糖含量達到最大值。此后繼續升高溫度，總多糖含量有所下降，因此最佳提取溫度選擇為90 ℃。這可能是因為提取溫度低于90 ℃時，隨著溫度的不斷升高，分子熱運動速度加快，多糖溶出的速率也隨之增快；而超過90 ℃時溫度過高，導致多糖發生降解[6]，所以總多糖含量降低。此外，高溫也會導致其他雜質溶于溶劑的速度增快，不利于實驗的進行。

圖1 溫度對總多糖含量的影響

2.2 提取時間對總多糖含量的影響

如圖2所示，提取時間的長短對總多糖含量有明顯的影響。提取時間在20～60 min時，隨著提取時間的增加，總多糖含量呈現出上升趨勢，并且在60 min達最大值，隨后逐漸降低，因此最佳提取時間選擇為60 min。當提取時間過短時，油茶果殼粉末與水未充分接觸，因此不能將多糖充分提取出來，總多糖含量相對較低；但是當提取時間過長時，會對多糖的結構造成一定程度上的破壞[7]，導致總多糖含量下降。

圖2 提取時間對總多糖含量的影響

2.3 料液比對總多糖含量的影響

如圖3所示，總多糖含量隨著用水量的增加先是不斷增加，在料液比為1∶30時達到最大，之后有所降低，故最佳料液比選擇為1∶30（g∶mL）。料液比過高或過低都會對總多糖含量造成影響，過高會使油茶果殼粉末無法充分吸水[8]，導致總多糖的提取率較低；比值過低則會導致提取出來的總多糖濃度過低。

圖3 料液比對總多糖含量的影響

2.4 響應面法對油茶果殼多糖提取工藝的優化

響應面法的實驗結果見表2。運用Design expert 8.0數據分析軟件對實驗數據進行多元回歸擬合，設提取溫度、提取時間、料液比分別為A、B、C，以總多糖含量為響應值進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸模型為Y=101.19+17.83A-2.31B-2.89C-0.14AB-2.99AC-4.69BC+1.32A2+1.45B2-0.53C2。

表2 響應面優化總多糖含量的實驗設計與結果

進一步對模型及回歸系數進行回歸分析，總多糖含量模型及回歸分析結果如表3所示。回歸模型P＜0.000 1（極顯著），其失擬項P=0.272 8＞0.050 0（不顯著），說明模型擬合程度良好，可以對回歸方程相應回歸值進行預測，同時模型回歸系數R2=0.975 4（＞0.800 0），調節后的回歸系數R2=0.943 7，表明94.73%的數據可用該模型解釋，方程可靠性較高。

表3 總多糖含量模型及回歸系數的回歸分析結果

分析相關數據可知，一次項溫度對總多糖含量的影響極顯著（P＜0.000 1），料液比對總多糖含量的影響顯著（P＜0.05），提取時間對總多糖含量的影響不顯著（P＞0.05）。分析各因素的主效應關系為A＞C＞B，即溫度＞料液比＞提取時間。其二次項交互作用BC對總多糖含量的影響顯著（P＜0.05），AB、AC對總多糖含量的影響不顯著（P＞0.05）。

驗證試驗結果：根據回歸方程模型，得到預測的最優條件為提取溫度99.948 ℃、提取時間74.546 min、料液比1∶20.922（g∶mL），根據實際情況將該條件修正為提取溫度100 ℃、提取時間74.5 min、料液比1∶21（g∶mL）（根據實驗可調整的參數進行設置）。在此最優條件下經3次平行實驗驗證，得到實際的總多糖含量為126.0 mg/g（按照最優參數做實驗得到結果），與預測值總多糖含量（127.2 mg/g）相差不大，證實了預測值和實驗值之間的良好相關性。

2.5 油茶果殼多糖對RAW264.7細胞NO釋放的影響

采用Griess法測定NO的釋放量，用于指示油茶果殼多糖對巨噬細胞免疫活性的影響[9]。如圖4所示，對照組中RAW264.7細胞所釋放出的NO量比較少，為（1.84±0.45）μmol/L。陽性對照LPS組中RAW264.7細胞所釋放出的NO量顯著增加，為（32.34±0.64）μmol/L。當給藥濃度逐漸增大時，RAW264.7細胞所釋放出的NO量也隨之增加，表現出一定的劑量依賴性，并且在給藥800 μg/mL時達到最大[（34.71±1.93）μmol/L]。此外，油茶果殼多糖相較LPS而言，作用更為溫和，濃度為12.5～400.0 μg/mL時，藥物組中RAW264.7細胞所釋放出的NO量[（9.87±1.76）～（31.37±2.37）μmol/L]要低于陽性對照LPS組[（32.34±0.64）μmol/L]。以上結果說明油茶果殼多糖具有一定的免疫調節活性。

圖4 油茶果殼多糖對NO釋放的影響

2.6 油茶果殼多糖對RAW264.7細胞存活率的影響

采用MTT法測定細胞的存活率，用于指示油茶果殼多糖對RAW264.7細胞活性的影響程度。如圖5所示，在濃度為12.5～50.0 μg/mL時，RAW264.7細胞的存活率高于對照組，說明在該濃度范圍內油茶果殼多糖起到促進RAW264.7細胞增殖的效果，對其并無毒性。而當濃度在100.0～800.0 μg/mL時，RAW264.7細胞的存活率呈下降趨勢，具有一定的抑制作用，但是其抑制率并未超過陽性對照LPS組，表明油茶果殼多糖對RAW264.7細胞存活率的抑制作用較弱。

圖5 油茶果殼多糖對細胞存活率的影響

3 結論

本研究利用響應面法優化熱水提取油茶果殼中的總多糖，能夠較好地將多糖原有的結構保留下來，且方法成本低，操作較為簡便。實驗結果表明，油茶果殼總多糖的最佳提取工藝條件為溫度100 ℃、提取時間74.5 min、料液比為1∶21（g∶mL），預測可得總多糖含量127.2 mg/g，經3次平行試驗實際得到總多糖含量為126.0 mg/g，與預測值較為接近，表明該提取條件可行。此外，細胞實驗顯示油茶果殼多糖具有較強的免疫調節活性，值得進一步深入研究。