酒醅及窖泥中乳酸菌的篩選及產酸特性研究

毛 豪，王家勝，趙 婷，蔡開云，陳 萍，馮向東，明 聃，陳茂彬

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院,湖北省釀造工藝與裝備工程技術中心，湖北武漢 430068；2.湖北省稻花香酒業有限公司，湖北宜昌 443000）

乳酸菌是白酒釀造中必不可少的微生物，窖泥中乳酸菌是重要的產酸細菌，謝玉球等[1-2]在窖泥中分離的乳酸菌中發現不同種屬和不同生長特征的乳酸菌對白酒的風味貢獻是不一樣的。有研究表明，乳桿菌屬與甲氧基乙酸異戊酯、戊酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯等酯類物質呈正相關。乳酸是乳酸菌的主要代謝產物，被認為是白酒中四大酸之一，占白酒中有機酸的43%左右[3-5]，白酒中含有適量的乳酸能夠減輕酒體刺鼻的味道，減少澀味、增強余味、增加甜度使酒體協調醇厚[1]。此外有學者認為乳酸能催化新酒老熟[6]。在白酒生產過程中酒醅里的乳酸及乳酸乙酯會在蒸餾時進入酒體，由于乳酸的沸點較高不易揮發，一般情況下酒尾乳酸的含量大于酒身，發酵過程中產生的大部分乳酸不會被帶入酒體而是留在廢酒糟中[1，7]。

乳酸與乙醇通過酯化作用生成乳酸乙酯，被認為是白酒中的四大酯之一，在清香型白酒中乳酸乙酯是除了乙酸乙酯外的第二大主體香氣成分[8-9]，此外，乳酸乙酯與其他三大酯的比例對酒質有顯著的影響，酒體中適量的乳酸乙酯從香味上能“助香”，防止“爆香”，從口感上能減少苦澀味，增加醇厚感。乳酸菌在白酒發酵中有著重要的地位，研究乳酸和乳酸乙酯對改善和調控白酒的品質和風味有較為積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：馫香型白酒發酵醅、窖泥。

試劑及耗材：酵母浸粉、吐溫80、牛肉膏，雙旋微生物培養基制品廠；磷酸氫二銨、溴甲酚紫、氯化鈉、葡萄糖、醋酸鈉、檸檬酸三銨、K2HPO4·7H2O、MgSO4·7H2O、醋酸鈉·3H2O、MnSO4·4H2O，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇，阿拉丁試劑（上海）有限公司；草酸銨，天津市致遠化學試劑有限公司；結晶紫，天津市大茂化學試劑廠；番紅染色液，北京索萊寶科技有限公司。

儀器設備：DHG.9140A 恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；ZHJH-C1214B 超凈工作臺，上海智城分析儀器有限公司；UtiMae3000高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技公司；PHX智能生化培養箱，寧波萊福科技有限公司；TGL-16C 臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

MRS固體培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母浸粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫·80 1.0 mL、K2HPO4·7H2O 2.0 g、醋酸鈉·3H2O 5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、瓊脂粉15.0 g，加蒸餾水定容至1000.0 mL。

MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母浸粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫·80 1.0 mL、K2HPO4·7H2O 2.0 g、醋酸鈉·3H2O 5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g，加蒸餾水定容至1000.0 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的初篩

取各類樣品10.0 g，放入含有玻璃珠的90 mL無菌生理鹽水中，在30 ℃、180 r/min 下振蕩分散30 min，梯度稀釋后取100 μL涂布至含有溴甲酚紫的MRS 固體培養基中，35 ℃厭氧培養2 d。對單菌落劃線純化3～5 次后保藏于終濃度為20%的甘油管及MRS斜面中。

1.2.2 乳酸菌的復篩

將初篩得到的8 株產酸菌接種至MRS 液體發酵培養基中，按照2%的接種量35 ℃深層厭氧發酵7 d，采用高效液相色譜法測定乳酸含量，篩選出產乳酸性能最強的菌作為目的菌株。

1.2.3 菌種鑒定

將分離純化的8 株產酸菌制備菌液后送至北京六合華大基因科技有限公司進行檢測鑒定。

1.2.4 目的菌種的發酵特性研究

1.2.4.1 培養時間對L1的生長量及產酸量的變化

將MRS 液體培養基分裝于試管中，每支試管30 mL，將乳酸菌接種于MRS 培養基中進行活化，30 ℃下180 r/min培養18 h作為種子液，按2%的接種量接入試管中，30 ℃培養7 d，每隔1 d 取出3 個平行樣品，適當稀釋后以未接種培養基作為空白于600 nm 波長下用分光光度計測定吸光度，取平均值，以時間為橫軸繪制乳酸菌的生長曲線，同時對發酵液中的乳酸含量進行檢測。

1.2.4.2 接種量對L1生長量及產酸量的變化

將種子液按1%、1.5%、2%、2.5%、3%的接種量接入MRS 液體培養基試管中，30 ℃靜置培養7 d 后，以未接種MRS 培養基為空白對照于波長600 nm 下測定其OD 值，同時對乳酸含量進行檢測。

1.2.4.3 葡萄糖濃度對L1生長量及產酸量的變化

種子液按2 %接種量接入到葡萄糖含量分別為0.5 %、1 %、1.5 %、2 %、2.5 %的MRS 液體培養基試管中，30 ℃靜置培養7 d 后，以未接種MRS 培養基為空白對照于波長600 nm 下測定其OD 值，同時對乳酸含量進行檢測。

1.2.4.4 培養溫度對L1生長量及產酸量的變化

按種子液2 %的接種量接入MRS 培養基試管中，分別置于30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃靜置培養7 d 后，以未接種MRS 培養基為空白對照于波長600 nm 下測定其OD 值，同時對乳酸含量進行檢測。

1.2.4.5 初始pH值對L1生長量及產酸量的變化

分別調整初始MRS 培養基的pH 值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，接入2%的種子液，30 ℃靜置培養7 d后，以未接種MRS培養基為空白對照于波長600 nm下測定其OD值，同時對乳酸含量進行檢測。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

2.1.1 乳酸菌的初篩（平板顯色反應）

如圖1 所示，以8 株菌落為半徑，產生了一圈黃色透明圈，在pH 值大于6.8 的培養基中，溴甲酚紫為弱堿式結構，呈現為紫色，8 株菌株生長繁殖時，產生了酸性物質，使得pH 值降到5.2 以下，培養基中的溴甲酚紫為弱酸式結構，呈現為黃色。因此，當菌落周圍出現黃色透明圈時，說明菌株產生酸性物質，可以判斷這8 株為產酸菌株，將它們保藏至MRS斜面和甘油管中作為初篩菌株。

圖1 8株產酸菌平板顯色反應

2.1.2 乳酸菌的復篩

建立的乳酸標準曲線為y=9.0691x+0.3771，R2=0.9998。發酵7 d 后，將發酵產物膜過濾后進行HPLC檢測[10-11]，色譜圖如圖2所示，8株菌株全部產生乳酸，根據標準品可知，乳酸的出峰時間為4.290±0.02。乳酸標準品的標準曲線的線性相關系數在0.999 以上，可用于準確定量，根據線性方程可計算出樣品中對應乳酸的含量。菌種發酵7 d 后的pH 值與乳酸含量如圖3 所示，菌種L1—L8 的pH 值較空白普遍下降，說明8 株菌株都產生了酸性物質，使發酵液中的pH 值降低，菌株L1 的發酵液pH值最低為4.1，且產乳酸含量最高為4.865 g/L，說明菌株L1 的產乳酸能力與性能比其他菌株強，因此將菌株L1作為目的菌株。

圖2 8株乳酸菌產乳酸的HPLC色譜圖

圖3 發酵液中乳酸含量及pH值

2.2 菌種鑒定

將16S rDNA 序列進行NCBI-BLAST，通過比對L1 菌株與Weissella confusa相似性達100%并且與MT515858.1 菌株親緣關系最為接近，從BLAST結果中選取相似性較高的10 株菌并利用MEGA 7.0軟件構建L1菌株系統發育樹（NJ）[12]。

圖4 L1菌株發育樹

2.3 L1發酵特性的研究

2.3.1 培養時間對L1的生長量及產酸量的變化

由圖5A 中L1 隨著培養時間OD600的變化趨勢可知，在0～1 d 生長速率緩慢，是菌種生長的遲緩階段，細菌進入新的環境需要適應，生長較為遲緩；在1～2 d 生長速率加快，說明生長達到對數生長階段，細菌生長速率最快，且此時細菌的大小、生理活性等都比較典型，因此進行菌種鑒定時一般選用對數生長時期的菌種，第2 d時生長量達到峰值；在第2～3 d，菌種量保持相對穩定，菌種數量處于穩定期；在第3～4 d，菌種生長量下降，細菌生長繁殖速度減慢或者停止，死亡數大于生長量，菌種生長進入衰亡期。L1 的整個生長曲線符合微生物生長規律。由圖5B 中L1 的乳酸含量隨著培養時間的變化趨勢可知，在0～2 d，乳酸含量較低，此時乳酸菌生長量較低，導致乳酸產率低；隨著時間的延長，乳酸含量升高，這是由于菌體含量高，β-半乳糖苷酶的含量較多，活力較高。有研究表明，在一定條件下，乳酸的生成速率和β-半乳糖苷酶的活力呈現正相關；在第6 d，乳酸含量不再增長，隨著發酵時間的延長，乳酸過多使得pH 值降低，抑制了酶的活力，或者由于乳酸含量過高抑制了菌體的生長，菌體衰亡，導致乳酸含量不再增加。

圖5 L1隨著培養時間生長量及乳酸含量的變化

2.3.2 接種量對L1的生長量及產酸量的變化

接種量的大小決定菌種的生長速度，從而影響菌種代謝產物的含量。接種量過多，導致溶氧不足，代謝產物過多，不利于產物合成。由圖6A 中接種量對L1 的生長量影響可知，隨著接種量的增加，L1 的生長量隨之增加，當接種量≥2 %時，菌體量趨于平穩。由圖6B 中接種量對L1 產酸量的影響可知，當接種量為2 %時，乳酸含量達到峰值4.611 g/L，隨著接種量的增加，乳酸含量開始下降，這可能是由于在接種量變大時種子液中的有毒代謝物被大量帶入發酵體系，代謝產物的毒性抑制了乳酸的生成。結合接種量對菌體的生長及產乳酸的影響，當接種量為2 %時，菌種含量達到峰值的80 %以上，產酸含量達到最高，因此選擇2 %作為最佳接種量。

圖6 接種量對L1的生長量及產酸影響

2.3.3 葡萄糖添加量對L1 的生長量及產酸量的變化

葡萄糖作為菌種生長的必要物質，也是乳酸菌生產乳酸的重要原料，探究葡萄糖的添加量對發酵特性的影響是必要的。如圖7A 中葡萄糖添加量對乳酸菌生長量的變化趨勢所示，隨著葡萄糖含量的升高，生長量隨之升高，當達到1.5 %時，生長量趨于穩定。由圖7B 中葡萄糖的添加量對乳酸含量的影響可知，當葡萄糖含量為2.0 %時，乳酸含量最高，為5.15 g/L；葡萄糖添加量繼續升高，乳酸含量降低，這可能是由于底物濃度過高產生了底物抑制和高滲應激效應，導致乳酸產量變低。

圖7 葡萄糖含量對L1的生長量及產酸影響

2.3.4 培養溫度對L1的生長量及產酸量的變化

溫度對生物體內的酶有著很大的影響，對菌體生長量以及與乳酸合成有關的酶有一定的調控作用。由圖8A 培養溫度對乳酸菌生長量的變化趨勢可知，隨著溫度的升高，L1 的生長量隨之升高，當溫度為35 ℃時，OD600達到最大值為4.76，因此最適生長溫度為35 ℃，且產酸含量最高為4.56 g/L；超過35 ℃時，隨著溫度的升高，菌體生長量和產酸量都下降，說明溫度過高，減緩了乳酸菌體的生長，導致生長量下降，并且抑制了合成乳酸關鍵酶的活性，導致乳酸含量下降。

圖8 培養溫度對L1的生長量及產酸影響

2.3.5 初始pH值對L1的生長量及產酸量的變化

pH 值對細菌的生長有很大的影響，過酸過堿都會抑制菌種量，pH 值可以影響酶的活性、膜表面的表面電荷性質及通透性等從而影響細菌對營養物質的吸收及轉運。因此，找到細菌適宜的生長pH值是重要的。如圖9A中初始pH值對L1的生長量的變化趨勢所示，生存環境由酸到中性，菌體含量持續上升，當中性環境轉變為堿性環境時，生長量趨勢開始下降，說明L1 在中性環境中的生長量較好。如圖9B 中初始pH 值對L1 產乳酸含量的變化趨勢所示，隨著pH 值的升高，乳酸含量升高，L1在酸性環境中的生長量低；因此產物較低。當pH值為6.0 時，乳酸含量達到最高；當pH 值高于6.0時，乳酸含量隨之降低，這是由于生長量最高時，產物復雜，抑制了乳酸的合成，導致乳酸含量較低，生長量較低時，代謝產物種類較少，對酶的活性及菌體的抑制效果較弱，因此pH6.0 時乳酸含量最高，為4.53 g/L，而不是pH7.0 時生長量最大時的乳酸含量最高。

圖9 初始pH值對L1的生長量及產酸影響

3 討論

從樣品中分離的8 株產酸菌經過復篩得出L1菌株產乳酸能力最強；對乳酸菌L1 發酵性能進行分析，結果表明，最佳發酵時間為6 d，最佳接種量為2%，最佳葡萄糖添加量為20 g/L，最佳培養溫度為33 ℃，最佳初始pH6.0，在此條件下乳酸含量最高為5.341 g/L。

本實驗得到的乳酸菌具有與酵母菌進行復配直接共培養生產乳酸乙酯用于酒和食品調香的能力[9]。在釀造體系中乳酸菌是不可缺少的，當酒中出現乳酸乙酯含量不足，整體香味欠協調，酒體欠圓潤的問題時，可以在發酵過程或者制曲過程加入適量的乳酸菌強化發酵，提升酒的品質。