GATA3、IL-13基因多態性和IL-13水平與小兒結核病易感性的關系研究

楊英閣

河南省南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院，河南南陽 473052

小兒結核病是指16歲以下的兒童所患的結核病，與成人結核病一樣，也是由結核分枝桿菌引起，結核病在小兒呼吸系統疾病中發病率高達5%，尤其是在新生兒階段若治療不及時極易威脅生命安全[1-2]。影響小兒結核病的因素較多，除了外界環境的接觸外，機體本身的易感性也逐漸成為近年來研究的熱點，其中基因多態性能夠反映出同種人群對同種疾病的不同患病風險[3-4]。GATA3-白細胞介素(IL)-13基因通路被報道與肺部疾病相關，包括哮喘、支氣管哮喘等[5-6]，但是關于該基因通路與結核病，尤其是小兒結核病的研究較少。因此，本研究從2個關鍵基因GATA3和IL-13入手，重點分析其單核苷酸多態性(SNP)與小兒結核病易感性的關系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選取2019年12月至2020年12月于本院診治的根據2017年版《中華人民共和國衛生行業標準肺結核診斷》標準，痰培養抗酸桿菌陽性并結合影像學確診為肺結核的414例小兒結核病患兒作為觀察組，另選取456例同期來本院診治的無肺結核感染的上呼吸道感染患兒作為對照組。觀察組中，男242例，女172例；年齡1～14歲；平均體質量(33.21±13.21)kg；血壓正常406例；血糖正常410例；發熱411例。對照組中，男264例，女192例；年齡1～14歲；平均體質量(34.32±14.44)kg；血壓正常432例；血糖正常455例；發熱446例。所有患兒及家屬均了解本研究的情況，并在知情同意書簽字。本研究經本院醫學倫理委員會批準。兩組性別、年齡、體質量等比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取 用含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)的抗凝管采集每例患兒5 mL全血。使用Omega Mag-Binds Forensic DNA Kit 試劑盒(美國Omega公司，生產批號：20101109)提取血液的基因組DNA，完成后用ND2000型nanodrop(美國Thermo Fisher公司)測定DNA的濃度和純度，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2聚合酶鏈反應(PCR)進行單核苷酸多態性(SNP)分型 使用Oligo6.0設計SNP位點處的引物序列及其Taqman探針序列，見表1，引物合成由上海生工生物公司完成。將1 μL的DNA溶液和配制好的1.2 μL引物溶液(包括上、下游引物，探針引物各0.4 μL)加入到預先配制好的17.8 μL的TransStart Probe qPCR SuperMix(北京全式金生物公司)中，輕微振蕩混勻，放入bio-rad CFX96熒光定量PCR儀中，反應條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環。實驗結果由儀器自帶軟件生成。每個樣品做3個復孔，陰性對照使用焦碳酸二乙酯(DEPC)水，陽性對照使用含有該序列的陽性質粒(由上海生工生物公司合成)。基因型的判定：靠近FAM橫坐標為野生純合型，靠近VIC縱坐標為突變純合性，位于靠近45°線的位置為雜合型。

表1 SNP引物序列

1.3酶聯免疫吸附試驗檢測血清中IL-13水平 取觀察組患兒的血清約1 mL，向96孔板中滴加標準品。樣品孔中加入樣品，每個樣品3個復孔。混勻，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外，混勻，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min后每孔加終止液50 μL，終止反應。以空白空調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度。

2 結 果

2.1GATA3基因rs422628位點和IL-13基因rs20541位點的基因分型結果及其分布頻率 所有待測的患兒均得到了明確的基因分型結果，見圖1。在研究人群中，觀察組GATA3基因的rs422628位點TT、TC和CC 3種基因型頻率與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)；觀察組IL-13基因的rs20541位點GG和GA兩種基因型頻率與對照組比較差異均無統計學差異(P>0.05)，但是AA基因型頻率與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

表2 基因分型的頻率分布

注：A為rs422628位點的基因分型結果，方形圖示為TT基因型，圓形圖示為CC基因型，三角形圖示為CT基因型；B為rs20541位點的分型結果，圓形圖示為GG基因型，方形圖示為AA基因型，三角形圖示為AG基因型。

2.2rs422628位點不同模型分析小兒結核病的患病風險 顯性模型(TC+CC/TT)的OR值為1.100(P=0.950)，隱性模型(CC/TT+TC)的OR值為1.210(P=0.757)，超顯性模型中(TT+CC/TC)的OR值為0.981(P=0.920)。見表3。

表3 rs422628位點不同遺傳模型分析小兒結核病的患病風險

2.3rs20541位點不同模型分析小兒結核病的患病風險 顯性模型(AG+AA/GG)的OR值為1.746，P=(0.057)，隱性模型(AA/GG+AG)的OR值為3.349(P=0.008)，超顯性模型(GG+AA/AG)的OR值為1.018(P=0.944)，見表4。

表4 rs20541位點不同遺傳模型分析小兒結核病的患病風險

2.4rs422628和rs20541位點聯合作用與小兒結核病患病的關系 2個SNP位點同時發生純合突變的攜帶CC基因型和AA基因型的兒童，觀察組有19例，占4.6%，對照組有1例，占0.2%，兩組比較差異有統計學意義(P=0.043)，與未突變的野生純合型(TT+GG)比較OR值為28.500。見表5。

表5 rs422628 和rs20541位點聯合作用基因型的頻率分布及其OR值

2.5觀察組和對照組IL-13水平比較 觀察組血清IL-13水平高于對照組(P<0.05)，見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.6不同IL-13基因分型患兒IL-13水平比較 攜帶AA基因型患兒的血清IL-13水平高于攜帶AG和GG基因型患兒(P<0.05)，見圖3。

注：與AA基因型比較，**P<0.05。

3 討 論

小兒結核病是由外界結核分枝桿菌入侵體內造成的，既與外界的環境因素有關，也與自身體質和免疫力相關[7-8]。目前，關于免疫力的提高，除了養成良好的生活習慣和飲食補充身體必需微量元素外，并無實質性的有效措施。對于16歲以下的兒童，免疫力較差，容易受到外界細菌和病毒的侵入，因此，小兒結核病與兒童的免疫力是直接相關的[9-10]。影響免疫力的因素也有很多，目前受學者廣泛關注的是免疫因子信號傳遞通路的相關研究，免疫因子是免疫系統的直接信使，它們可以通過刺激或激活免疫細胞的活性來殺滅體內入侵的病毒和細菌[11-12]。

GATA3屬于鋅指結構的轉錄因子，對胸腺的發育和T細胞的分化有促進作用，rs422628位點是GATA3基因上的SNP突變位點，位于內含子區域，該位點的突變能夠影響GATA3的轉錄，從而影響其下游信號分子的表達，使T細胞的發育受到影響[13-14]。有研究表明，GATA-3在哮喘大鼠肺組織中的表達較高，通過抑制GATA-3的表達可減輕新生兒細菌性呼吸道炎癥反應[15]。但是本研究發現，在小兒結核病的易感性方面，觀察組rs422628位點TT、TC和CC3種基因型頻率與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，顯性、隱性和超顯性3種遺傳模型分析差異也均無統計學意義(P>0.05)，表明GATA3基因rs422628位點多態性與小兒結核病易感性的關聯不強。IL-13主要是由活化的T輔助細胞、肥大細胞、嗜堿細胞等細胞分泌，有相關研究表明，IL-13與支氣管哮喘、肺間質纖維化和急性肺損傷均有密切的關系[16-17]。IL-13可以阻斷腫瘤壞死因子誘導的激活蛋白-1和核因子κB激活，抑制相關炎癥因子的表達，降低炎癥因子對細胞的損傷[18]。此外，IL-13還可以促進B細胞的增殖和分化，以及分泌免疫球蛋白[19]。rs20541位點位于IL-13基因的編碼區，其突變可導致氨基酸由谷氨酰胺變為精氨酸，使IL-13基因的結構發生改變，進而影響免疫功能[20]。本研究發現，攜帶AA基因型的兒童屬于小兒結核病的易感人群，隱性模型的OR值為3.349(P=0.008)，提示該類兒童患病風險較高，且攜帶AA基因型兒童抵抗結核分枝桿菌病原入侵的免疫力較差。本研究進一步分析了rs422628與rs20541位點聯合作用與小兒結核病患病的關系，結果顯示，雖然rs422628位點單獨分析時與小兒結核病的易感性并無關聯，但是若rs422628位點純合突變型CC基因型與rs20541位點AA基因型同時存在，其OR值高達28.500(P=0.043)，表明GATA3基因rs422628位點純合型突變能夠在易感性方面起到輔助的促進作用，間接影響機體對結核分枝桿菌的抵抗能力。目前常見成人結核病易感人群血液IL-13水平升高的報道，鑒于IL-13基因與結核病有較高的易感性關系，本研究進一步分析了血清IL-13水平與IL-13基因rs20541位點各基因型的關系，結果顯示，觀察組攜帶AA基因型的患兒血清IL-13水平高于攜帶AG和GG基因型患兒，進一步證實IL-13基因rs20541位點AA基因型患兒的炎癥反應程度更高。

綜上所述，攜帶IL-13基因rs20541位點AA基因型的兒童對小兒結核病的易感性較高，患病風險較大。但是，SNP位點可能因為人種和樣本量的不同存在結果差異和多樣化。因此，如果可以獲得更大樣本量和不同民族、種族的細致劃分，會使研究結果更有說服力。