基于GEO數據庫的產后抑郁癥關鍵差異表達基因分析

賈 穎，卓 頻，趙 爽，胡文燕

天津倍科為醫學檢驗實驗室，天津 301799

產后抑郁癥(PPD)是指女性在產褥期發生的一種嚴重的情緒障礙疾病，其臨床發病率為10%～15%[1-2]。其癥狀包括負面情緒(如悲傷、焦慮、絕望等)，思維遲緩，睡眠障礙，精力不足，迫害妄想，甚至出現傷害嬰兒或自殺行為等[1]。PPD不僅嚴重影響產褥期女性的健康，同時還會損害正常的母嬰關系，影響到后代的正常生長發育[2]。

研究表明，免疫系統參與了重性情緒障礙疾病的發生發展。對于產褥期女性而言，從妊娠期到產褥期的過渡伴隨著復雜的免疫適應性調節反應[3]，產后階段的特征是細胞因子水平升高，免疫細胞浸潤增多[4-5]，與妊娠晚期相比，產褥期T調節細胞(Treg細胞)亞群顯著增加[5]。PPD的病理生理機制復雜，免疫調節功能障礙可能與PPD的發生發展有關。盡管有研究表明，抗/促炎細胞因子白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、C反應蛋白和皮質醇等可以作為PPD外周血生物標志物[6]，還有研究表明，PPD的發生與雌激素受體α基因(ESR1)、5-羥色胺轉運蛋白(5-HTT)等基因表達有關[4]，但PPD與免疫相關的病理生理機制仍不清楚，還需要進行更多深入的系統研究。

近年來，基因測序技術與生物信息學分析相結合的研究策略為從分子水平識別生物標志物和理解精神障礙疾病的病理生理學基礎提供了強有力的工具[7]，本研究旨在利用生物信息學分析方法從PPD患者的轉錄本表達層面來探明產褥期女性體內可能發生的與PPD相關的免疫相關基因網絡與生物學變化，并尋找外周血中PPD潛在的生物標志物，以期為闡明PPD的疾病生理機制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1材料來源 登錄NCBI的GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，選擇GEO Data Sets，輸入“postpartum depression”檢索相關數據，根據研究樣本及類別篩選出符合條件的芯片。選取編號為GSE45603的芯片數據及其注釋文件進行下載(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45603)。數據來自GPL10558 Illumina Human HT-12V4.0 expression bead chip。選取GSE45603中的16例產褥期PPD患者樣本以及5例健康對照樣本進行分析。

1.2篩選差異表達基因 利用R語言(V3.6.2)對原始基因進行二次分析，選取limma包對芯片數據的差異表達基因進行分析，為了得到更多的差異表達基因，將顯著差異表達基因的篩選條件設定為P<0.05，差異倍數|logFC|>0.5，其中，logFC>0.5的基因作為上調基因，logFC<-0.5的基因作為下調基因，得到差異表達基因文件后運用plot包繪制火山圖。

1.3差異表達基因的功能富集分析 利用metaspace軟件對篩選出的差異表達基因進行基因注釋，并進行基因本體論(GO)中的生物學過程和代謝通路的功能富集分析。選取注釋到GO功能富集的前10位進行柱狀圖展示，選取注釋到代謝通路富集的前10位進行氣泡圖展示。

1.4構建差異表達基因編碼的蛋白質-蛋白質互作(PPI)網絡及篩選關鍵基因 通過metaspace軟件對差異表達基因進行PPI網絡圖分析，按照默認參數值(physical score > 0.132，STRING)篩選出互作蛋白對。先將所有的差異表達基因進行相互作用網絡分析，之后采用MCODE算法識別蛋白質緊密相連的鄰近區域，將網絡進行聚類，對得到的差異表達基因進行注釋，并選取校正后P值最小的前3位代謝通路放入列表進行展示。根據PPI網絡聚類中差異表達基因的得分值(Cluster-Score>1)篩選參與免疫相關生物學過程及代謝通路的核心關鍵基因。

2 結 果

2.1差異表達基因的篩選 獲得了714個差異表達基因(圖1)，包括149個上調基因及565個下調基因。

注：淺灰色部分為上調基因，黑色部分為下調基因。

2.2差異表達基因的GO功能富集分析和代謝通路富集分析 應用metaspace軟件對得到的差異表達基因進行GO功能富集分析(圖2)和代謝通路富集分析(圖3)。GO功能富集分析結果表明，差異表達基因主要集中在細胞因子產生的正向調節、樹突狀細胞分化的調節、樹突狀細胞分化、適應性免疫反應的調節、前體代謝物和能量的產生、免疫效應過程、參與免疫反應的白細胞激活、白細胞介導的免疫調節、白細胞分化、T細胞活化等生物學過程中。代謝通路分析結果表明，差異表達基因在中性粒細胞脫粒、適應性免疫系統、淋巴細胞和非淋巴細胞之間的免疫調節相互作用，抗原加工和呈遞等通路中顯著富集。

圖2 GO功能富集(前10位)

圖3 代謝通路富集(前10位)

2.3差異表達基因的關鍵MCODE模塊及關鍵差異表達基因篩選 分析得到4個關鍵MCODE模塊及其對應的功能與代謝通路信息(表1)。根據PPI網絡聚類中差異表達基因的得分值(Cluster-Score>1)篩選出11個參與免疫相關生物學過程及代謝通路的關鍵差異表達基因，其中，CD3G、CD8A、CD8B、ABL1、CCR7、CXCR6表達顯著上調(P<0.05，logFC>0.5)，而HLA-G、HLA-C、CCR1、SSTR2、LPAR2表達顯著下調(P<0.05，logFC<-0.5)。

表1 差異表達基因PPI網絡圖對應注釋信息

3 討 論

PPD是產褥期女性常見的精神系統疾病，其發病率呈現不斷上升趨勢。PPD的發病因素多樣，與產褥期女性的遺傳、心理、社會、生理以及免疫等因素相關，會給個人、新生兒以及家庭和社會帶來一系列不良后果[2]。隨著國家二孩、三孩政策的實行，妊娠期產褥期女性越來越多，為防止更多的產褥期女性發展成為PPD，及時的診斷和干預十分重要。

從生物因素的角度，目前已有研究揭示了PPD與女性產褥期激素異常波動以及體內產生的應激反應導致的免疫系統功能障礙有關[3]，但是未闡明PPD的具體發病機制，還需要更多更深入的研究進行分析。

本研究對得到的差異表達基因進行GO功能富集分析并構建PPI網絡，結果顯示，PPD患者體內免疫功能失調，白細胞、T細胞活化，樹突狀細胞成熟，適應性免疫系統增強，但抗原呈遞功能減弱。有研究指出，抑郁癥患者體內免疫功能障礙的來源可能與感染、微生物組的改變、疾病、壓力和其他因素相關[6]，本研究顯示，PPD患者體內細胞因子產生的正向調節活動增強，提示患者體內炎癥反應增強，其可能來源于患者產褥期虛弱、經受病原微生物感染或其他壓力性因素。

對于得到的11個關鍵的差異表達基因，研究表明，CD3G是CD3分子的一種亞型，CD3分子在轉導T細胞受體(TCR)識別抗原所產生的活化信號中起重要作用[8]；CD8+T細胞主要參與抗病毒免疫、抗腫瘤免疫及移植排斥反應。CD8分子主要表達于細胞毒性T細胞表面，能與MHCⅠ類抗原結合，增強TCR識別靶細胞(如病毒感染細胞、腫瘤細胞等)表面的p-MHCⅠ類分子復合物。CD4與CD8分子比例下降提示免疫系統受到損傷[9]。鄔賢鳳等[10]的研究結果顯示，PPD患者CD3、CD4表達水平顯著下降，而CD8表達水平顯著上升，同時相關性分析結果顯示，PPD與CD3、CD4表達水平及CD4/CD8呈負相關，而與CD8表達水平呈正相關。該結果與本研究中CD8基因表達顯著上調結果一致，提示PPD患者體內T細胞免疫功能下調。ABL1蛋白主要參與細胞的分化、分裂與應激反應等，ABL1蛋白的SH3結構域的缺失會使ABL1成為原癌基因，從而導致細胞發生癌變。HLA-G與HLA-C均屬于非經典HLA-Ⅰ類分子，有研究報道HLA基因的下調可能導致抗原提呈減少，從而促進腫瘤免疫逃逸[11]。也有研究表明，一些病毒，如EB病毒(EBV)可以通過抑制抗原提呈而有效逃避免疫系統細胞毒性T細胞的識別，避免免疫系統的監視[12]。CCR7基因編碼的蛋白質是G蛋白偶聯受體家族的成員，該受體被認為是EBV感染B細胞的介質[13]，在各種淋巴組織中表達并激活B和T細胞，可以控制記憶T細胞向炎癥組織的遷移，并刺激樹突狀細胞成熟。趨化因子CCR1及其受體介導的信號轉導對于效應免疫細胞招募到炎癥部位至關重要，與多種人類疾病有關，包括類風濕關節炎、多發性硬化、多發性骨髓瘤和相關的溶骨性疾病[14]。研究顯示，CCR1持續表達于嗜中性粒細胞、單核細胞、T和B細胞等免疫細胞表面[15]。CXCR6主要在幾個T細胞亞群和骨髓基質細胞中表達，參與調節T細胞向各種外周器官組織(肝、脾紅髓、腸、肺和皮膚)遷移的信號通路，并促進細胞與樹突狀細胞和成纖維細胞網狀細胞的相互作用[16]。本研究中CCR7與CXCR6表達上調，而CCR1表達下調，提示PPD患者體內可能存在由于病毒感染引起的炎癥反應。SSTR2可介導生長抑素的釋放，從而抑制內皮細胞增殖以及誘導細胞凋亡，此外，SSTR2參與機體內抗腫瘤反應，其低表達有可能促進腫瘤細胞增殖、遷移作用[17]。LPAR2蛋白作為溶血磷脂酸(LPA)受體，可能在LPA促進腫瘤細胞遷移的過程中起主要作用[18]。本研究中，SSTR2和LAPR2顯著下調，表明PPD患者體內免疫功能低下。鑒于EBV是一種人群易感病毒，感染率高達90%，而在PPD患者體內可能存在EBV逃逸免疫識別，同時增殖活化T細胞，引起免疫系統損傷的路徑，進而導致PPD的發生，但還需更多研究來證明該機制的可能性。

本研究通過分析GEO數據庫中的GSE45603芯片數據，得到與免疫相關的4個關鍵MCODE模塊以及11個關鍵差異表達基因，這11個關鍵差異表達基因可作為PPD早期檢測的潛在分子標志物。此外，本研究從分子功能與生物過程及代謝通路的角度進一步闡述了PPD可能的發病機制，為PPD的發生發展尋找新的作用靶點提供了新的思路。但是PPD的病理生理機制復雜，本研究僅關注PPD與免疫相關的差異表達基因及其代謝通路，研究結果還需要進一步的臨床試驗進行驗證。