重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合利多卡因治療兒童復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍對鐘基因及炎癥因子的影響

宋佳凝，孔楠楠

西安市兒童醫(yī)院口腔科，陜西西安 710003

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍(RAS)是一種口腔黏膜潰瘍性疾病，其特征是口腔黏膜中具有局限性邊緣的小潰瘍反復(fù)發(fā)作，主要影響非角化黏膜[1]。RAS常引起嚴(yán)重的疼痛和不適，影響口腔功能，如進(jìn)食和飲水等，從而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，RAS 發(fā)病率可達(dá)20%，且是青少年最常見的口腔黏膜疾病[3]。RAS 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但可能與免疫功能障礙、應(yīng)激、創(chuàng)傷、遺傳因素和維生素缺乏等有關(guān)[4]。

研究表明，人體幾乎所有細(xì)胞中都存在鐘基因，鐘基因的異常表達(dá)與各種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。Period1(Per1)和Cry1是重要的核心鐘基因，多項(xiàng)研究證實(shí)Per1和Cry1在胃癌和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，但是其在兒童RAS中的作用尚不清楚[6-7]。此外，臨床以藥物治療RAS為主，常見藥物有重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rb-bFGF)、利多卡因和維生素等[8]。因此，本研究探究rb-bFGF聯(lián)合利多卡因治療兒童RAS對患兒鐘基因及炎癥因子的影響，以期為臨床治療提供借鑒。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2020年1月本院收治的RAS患兒120例為研究對象，隨機(jī)分為rb-bFGF組和聯(lián)合組，每組60例。rb-bFGF組中，男24例，女36例；年齡(7.5±2.1)歲；潰瘍分級：Ⅱ級19例，Ⅲ級26例，Ⅳ級15例。聯(lián)合組中，男26例，女34例；年齡(7.8±1.9)歲；潰瘍分級：Ⅱ級18例，Ⅲ級26例，Ⅳ級16例。兩組患者一般資料(性別、年齡和潰瘍分級)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過本院倫理委員會審批同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患兒及家屬簽署知情同意書；(2)符合RAS診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(3)身體一般狀況良好。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他感染及惡性腫瘤；(2)利多卡因和rb-bFGF過敏；(3)重要臟器功能不全。

1.2儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購自美國賽默飛世爾科技公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-6和IL-8酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3方法 用藥前對患兒進(jìn)行口腔清潔，rb-bFGF組在餐前涂抹適量rb-bFGF凝膠(國藥準(zhǔn)字S10980077，珠海億勝生物制藥有限公司)在潰瘍面，3次/天。聯(lián)合組在餐前同時(shí)涂抹rb-bFGF和利多卡因(國藥準(zhǔn)字H20180007，北京泰德制藥股份有限公司) 在潰瘍面，3次/天，用藥后半小時(shí)內(nèi)禁止飲食漱口，總療程7 d。分別記錄兩組患兒臨床癥狀(疼痛消失、潰瘍愈合、進(jìn)食改善)緩解時(shí)間。

PCR檢測：患者抽取清晨空腹時(shí)的靜脈血，離心后按照試劑盒的說明書依次提取RNA，評估RNA的完整性并反轉(zhuǎn)錄為DNA。采用PCR檢測鐘基因Per1和Cry1，基因擴(kuò)增的條件：酶活化95 ℃，10 min；變性95℃，15 s；退火及延伸60 ℃，循環(huán)55次。

ELISA檢測：患者抽取清晨空腹時(shí)的靜脈血，離心后獲得上清，按照試劑盒的說明書檢測IL-4、IL-6和IL-8水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床癥狀緩解時(shí)間比較 rb-bFGF組臨床癥狀(疼痛消失、潰瘍愈合、進(jìn)食改善)緩解時(shí)間均長于聯(lián)合組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組臨床癥狀緩解時(shí)間比較

2.2兩組鐘基因表達(dá)水平比較 兩組鐘基因表達(dá)的比較首先進(jìn)行RNA質(zhì)檢，采用瓊脂糖凝膠電泳，兩組18 s條帶及28 s條帶明顯，28 s和18 s RNA比值約為2∶1，5 s較為模糊，提示兩組RNA完整無降解。見圖1。

注：1～3代表rb-bFGF組RNA電泳，4～6代表聯(lián)合組RNA電泳。

治療前兩組患者鐘基因Per1和Cry1表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與治療前比較，治療7 d后兩組患者鐘基因Per1和Cry1表達(dá)水平均下降，且治療7 d后rb-bFGF組高于聯(lián)合組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組鐘基因表達(dá)水平比較

2.3兩組炎癥因子水平比較 治療前兩組患者炎癥因子IL-4、IL-6和IL-8水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與治療前比較，治療7 d后兩組患者炎癥因子IL-6和IL-8水平下降，且rb-bFGF組高于聯(lián)合組(P<0.05)；炎癥因子IL-4水平升高，且rb-bFGF組低于聯(lián)合組(P<0.05)。表3。

表3 兩組炎癥因子表達(dá)的比較

3 討 論

RAS屬于口腔黏膜慢性炎癥性疾病，該病最典型的癥狀是反復(fù)出現(xiàn)單一或多個(gè)疼痛性糜爛和潰瘍，主要出現(xiàn)在口唇、臉頰和舌，偶爾也可發(fā)生在腭和牙齦黏膜[10]。迄今為止，RAS 的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。潛在的致病因素包括遺傳易感性、病毒和細(xì)菌感染、食物過敏、維生素和微量元素缺乏、全身性疾病(如乳糜瀉、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、艾滋病)、氧化應(yīng)激增加、機(jī)械損傷和焦慮等，其中生物節(jié)律和炎癥因子失調(diào)是致病的重要原因之一[11]。目前臨床上治療RAS以對癥治療、抑制炎癥和降低復(fù)發(fā)率為原則。

rb-bFGF是來源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞具有多種功能的細(xì)胞因子，可發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，有助于血管新生和組織損傷后修復(fù)，此外還可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。rb-bFGF通過對組織的刺激作用，進(jìn)而改善局部血液循環(huán)，調(diào)節(jié)免疫功能[12]。利多卡因是一種酰胺類局部麻醉藥物，具有穿透性好、靈敏度高、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，常用于局部麻醉及心律失常治療，具有見效快、效果較強(qiáng)且持久等優(yōu)點(diǎn)[13]。研究報(bào)道，利多卡因凝膠涂抹在RAS潰瘍面可有效緩解患者疼痛[14]。本研究結(jié)果顯示，與rb-bFGF組相比，聯(lián)合組效果更佳，主要反映在更短的臨床緩解時(shí)間，更輕的炎癥反應(yīng)和合適的生物節(jié)律。這可能由于兩藥聯(lián)用的協(xié)同效應(yīng)，不僅在局部也在全身發(fā)揮作用，并經(jīng)由多種機(jī)制改善患者的癥狀。

目前的研究表明，鐘基因的異常表達(dá)與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。已發(fā)現(xiàn)14個(gè)鐘基因，包括Per1、Period2、Period3、Bmal1、Clock、Tim、CK1ε、NPAS2、REV-ERBs、Dec1、Dec2、Cry1、Cry2 和 ROR。這些鐘基因調(diào)節(jié)著人類基因中大約 43% 編碼蛋白質(zhì)的基因[15]。因此，它們對體內(nèi)的許多生理過程具有重要的調(diào)節(jié)作用。Per1和Cry1是核心鐘基因[16]。在本研究中，筆者分析了rb-bFGF聯(lián)合利多卡因治療后患者鐘基因的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)治療后Per1和Cry1表達(dá)水平降低，且聯(lián)合組降低更明顯，這提示RAS可能引起患者生物節(jié)律的異常，聯(lián)合治療有效促進(jìn)了生物節(jié)律的恢復(fù)。

炎癥因子的失調(diào)是RAS的重要致病因素，IL-4是產(chǎn)生于免疫系統(tǒng)中的一類細(xì)胞因子，屬于抗炎介質(zhì)，可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中白細(xì)胞的活性，還可參與抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視[17]。此外，研究表明IL-4水平變化與RAS病情緊密相關(guān)[18]。IL-6和IL-8 屬于趨化細(xì)胞因子，在人類生殖生理和病理過程中起一定的調(diào)節(jié)作用，其可通過細(xì)胞趨化作用實(shí)現(xiàn)對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、殺菌和減少細(xì)胞損傷的目的，其可作為反映口腔潰瘍炎癥程度的重要指標(biāo)[18]。本研究結(jié)果證實(shí)，rb-bFGF 聯(lián)合利多卡因可有效減輕炎癥反應(yīng)，其原因可能為兩藥聯(lián)合可增加抑炎因子IL-4表達(dá)，減少促炎因子IL-6和IL-8表達(dá)，從而改善病變黏膜微循環(huán)，減輕黏膜損傷。

綜上所述，rb-bFGF 聯(lián)合利多卡因治療兒童RAS可有效緩解臨床癥狀，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)生物節(jié)律的恢復(fù)。但本研究存在局限性，納入樣本數(shù)量有限，所得出的結(jié)論仍需大樣本多中心隨機(jī)對照試驗(yàn)證實(shí)。