miR-566與miR-1183靶向抑制RHD基因表達的研究*

王 琳，張印則，吳宗勇，岳賀佳，劉瑞琪，蔡佩佩，陳家倪，楊翠紅，齊 軍△

1.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院深圳醫院輸血科，廣東深圳 518116；2.深圳大學總醫院輸血科，廣東深圳 518055

Rh血型系統由1p34.3-1q36.1控制編碼，有54種抗原，是僅次于ABO血型的具有重要臨床意義的血型系統[1-2]。RhD蛋白在Rh血型系統中免疫原性最強，因此在臨床輸血及母嬰同種免疫中起著重要作用[3]。D抗原的變異型包括“弱D”“部分D”“DEL型”等。其中“弱D”的特征是紅細胞表面D抗原位點顯著性減少，但其免疫反應性不變[4]。因此，明確“弱D”表型發生的分子機制，對于準確鑒定RhD血型，指導臨床輸血與預防新生兒溶血病等均有重要意義。有學者發現，大部分“弱D”表型與RHD基因結構相關[5]，HOURIA等[6]認為“弱D”表型D抗原低水平是由于低水平RHD基因轉錄所致。

研究表明，微小RNA(miRNA)通過干預基因表達，可調節細胞的新陳代謝、分化、增殖、凋亡，其在基因的表達調控中起著重要的作用[7-8]。本研究以3例Rh“弱D”表型樣本和6例RhD陽性樣本為研究對象，通過生物信息學的方法篩選與調控RHD基因表達相關的miRNA，構建雙熒光素酶報告基因載體，探索miRNA與RHD基因表達的關系，以期進一步研究“弱D”表型的分子機制與miRNA的關系。現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源 6例RhD陽性及3例“弱D”表型血液樣本均來源于深圳市血液中心，于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2儀器與試劑 Dual-Gloluciferase Assay system(美國Promega公司，批號：0000129139)；293T細胞株(深圳博奧康生物科技有限公司)；NotI限制性內切酶(美國Thermo公司，批號:00155534)、XhoI限制性內切酶(美國Thermo公司，批號:00209345)；質粒提取試劑盒(美國Omega公司，批號:00D6943020000C19O091)；miRNA mimcs和miRNA mimics的空白對照(廣州銳博生物科技有限公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司，批號：8116402)；Lilpofectamine 2000(美國Invitrogen公司，批號:136719)；SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)[寶生物工程(大連)有限公司，批號：AK9204]；primeSTAR HS(primix)[寶生物工程(大連)有限公司，批號：1603057]；PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司，批號：00382191]；psicheck2 vector(美國Promega公司，批號：0000095842)；miRNeasy Serum/Plasma kit(美國Qiagen公司,批號:154023933)。

1.3生物信息學預測調控RHD基因表達的miRNA 利用生物信息學軟件TargetScan、PicTar和miRWalk，在線搜索可作用于RHD基因的miRNA，選擇靶標率靠前的5個miRNA進行分析。

1.4雙熒光素酶報告基因載體的構建

1.4.1引物 根據Pubmed Genebank ID 6007確定RHD基因3′-非編碼區(3′-UTR)，采用Oligo 8.0軟件設計聚合酶鏈反應(PCR)引物，RHD-3UTR-F:CCCTCGAGCCGCCTGCATTTG-TACGTGAG；RHD-3UTR-R:GAATGCGGCCGCACAAGCACTGCCACGTTCAC(上海生工生物科技有限公司合成)。

1.4.2PCR合成RHD基因3′-UTR片段 以人基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為50 μL：2×primeSTAR HS(primix) 25 μL，模板100 ng，上游引物(100 μmol/L)0.4 μL，下游引物(100 μmol/L)0.4 μL，加雙蒸水(ddH2O)至50 μL。設置PCR反應條件為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸75 s，30個循環。

1.4.3載體構建 將上述PCR產物純化后進行NotI/XhoI雙酶切，與雙熒光素酶報告基因載體psicheck2連接，然后轉化至DH5α感受態細胞。隨機挑取克隆放大培養后提取質粒DNA。

1.4.4酶切驗證及測序 把提取的質粒DNA用NotI和XhoI做雙酶切處理，用瓊脂糖凝膠電泳驗證RHD基因3′-UTR序列是否成功插入載體；選取酶切驗證正確的克隆進行測序。

1.5報告基因載體與miRNA mimics共轉染細胞 用DMEM培養基于37℃，5% CO2的條件下培養293 T細胞。96孔板，100微升/孔，1.5×104個/孔，培養24 h。取濃度為10 μmol/L的5個miRNA mimics和miRNA mimics的空白對照(miRNA-NC)各1 μL，分別與9 μL OPTI-MEM培養基混合；取100 ng/μL的靶基因3′-UTR報告基因載體2 μL，與13 μL OPTI-MEM培養基混合；取1 μL Lipofectamin 2000與24 μL OPTI-MEM培養基混合。5 min后三者混合，共50 μL。輕輕搖勻靜置20 min，然后加至細胞內。做3個平行孔。轉染48 h后加入底物，測定熒光值。

1.6實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miRNA的表達 提取9個樣本的RNA，將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，熒光定量檢測miRNA的表達量。正向引物為：miRNA566-GGGCGCCTGTGATCCCAAC，miRNA1183-CACTGTAGGTGATGGTGAGAGTG，miRNA1207-TGGCAGGGAGGC TGGGAG。20 μL反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL，正向引物(10 μmol/L)0.4 μL，反向通用引物(10 μmol/L)0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA模板 0.4 μL，ddH2O 8.4 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 12 s，60 ℃ 34 s，40個循環，每個樣本及內參(U6)進行3次重復，陰性對照以ddH2O代替cDNA模板進行熔解曲線檢測。miRNA相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法計算。

2 結 果

2.1調控RHD基因表達的miRNA 生物信息學預測的靶標率靠前的5個調控RHD基因表達的miRNA分別為miR-566、miR-939、miR-1183、miR-1207和miR-1222。

2.2雙熒光素酶報告基因載體的構建 成功構建了RHD基因3′-UTR雙熒光素酶報告基因載體，將該報告基因載體命名為priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR。PCR合成的RHD基因3′-UTR序列，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果見圖1，擴增片段1 200 bp與理論值相符。克隆后挑取6個單菌落經PCR驗證，片段長度為1 200 bp，證明目的片段已成功插入載體，結果見圖2。在6個單菌落中選取3個單菌落擴大培養提取質粒DNA，雙酶切priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR，得到2個條帶，RHD基因3′-UTR片段與預期大小相符，見圖3。priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR的測序圖顯示其RHD基因3′-UTR序列與參考序列完全一致。

注：M為Marker；1為PCR擴增產物。

注：M為marker；1～6為6個菌落的PCR產物；7為陰性對照；8為陽性對照。

注：M為marker；1～3為priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR的雙酶切產物。

2.3miRNA與RHD基因的靶點驗證結果 priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR與miR-566、miR-939、miR-1183、miR-1207、miR-1222共轉染細胞的相對熒光素酶活性分別為0.63±0.02、1.08±0.18、0.87±0.11、0.86±0.05、0.99±0.01。轉染miR-566、miR-1183、miR-1207可以使priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR的相對熒光素酶活性較miRNA-NC分別降低37%、13%、14%(P<0.05)，而miR-939與miR-1222沒有使該載體的相對熒光素酶活性降低。見圖4。

注：與miRNA-NC比較，*P<0.05。

2.4qRT-PCR定量測定miRNA的差異表達 雙熒光素酶報告基因實驗發現，miR-566、miR-1183和miR-1207對RHD基因3′-UTR有靶向作用,于是檢測miR-566、miR-1183和miR-1207在RhD陽性及“弱D”表型樣本中的相對表達量。結果顯示，miR-566和miR-1183在“弱D”表型樣本中的相對表達量明顯高于RhD陽性樣本(P<0.05)，見圖5。

注：與RhD陽性樣本比較，*P<0.05。

3 討 論

miRNA是由20～25個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，它能通過堿基互補配對方式識別靶信使RNA(mRNA)，并且根據互補程度的不同指導沉默復合體阻遏靶mRNA的翻譯或者降解靶mRNA，進而發揮相應的生物學作用[9]。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNA也可以有同一個靶基因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來精細調控某個基因的表達。miRNA參與多種調節途徑，包括發育、造血過程、病毒防御、脂肪代謝、器官形成、細胞增殖和凋亡等[10]。

Rh血型系統是人類紅細胞血型系統中最復雜、最重要也是最富有多態性的一個系統，D抗原是人RHD基因表達的最重要的抗原。RHD基因變異較多，其中“弱D”是其編碼D抗原數量較少[11-12]。miRNA可以通過部分互補結合到目的mRNA的3′-UTR，以一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，因而可能成為調控Rh血型系統的“弱D”表型表達的關鍵分子。

本研究利用生物信息學方法分析預測潛在靶向調節RHD基因表達的miRNA。在此基礎之上，筆者構建了RHD基因3′-UTR雙熒光素酶報告基因載體priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR，將預測的miR-566、miR-939、miR-1183、miR-1207、miR-1222和priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR共轉染293 T細胞，研究其相對熒光素酶活性變化。結果表明，miR-566能使priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR的相對熒光素酶活性降低37%，對其有明顯的抑制作用(P<0.05)，miR-1183、miR-1207亦使priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR的相對熒光素酶活性分別降低13%(P<0.05)和14%(P<0.05)，說明miR-566、miR-1183和miR-1207潛在靶向調控RHD基因3′-UTR。于是筆者在RhD陽性及“弱D”表型兩組樣本中檢測了miR-566、miR-1183、miR-1207的表達，發現miR-566和miR-1183在“弱D”表型樣本中的相對表達量明顯高于RhD陽性樣本(P<0.05)。因而推測miR-566、miR-1183能下調RHD基因的表達，這可能是使Rh血型系統“弱D”表型出現的相關分子機制。但為什么miR-1207在“弱D”表型和RhD陽性樣本中的相對表達量差異無統計學意義還有待進一步研究[13]。此外，有報道稱，miR-566通過調控WNT6而影響乳腺癌的進展[14]；而miR-1183對膠質瘤細胞可能存在調控作用[15]。

miR-566與miR-1183在“弱D” 和RhD陽性標本中的相對表達量的顯著差異，為在miRNA水平研究Rh血型中“弱D”表型的分子機制奠定了基礎，同時為RhD陽性與“弱D”表型間的鑒別提供了新的分子檢測方法。

綜上所述，本研究成功構建了RHD基因3′-UTR的雙熒光素酶報告基因載體，同時初步證明RHD基因的3′-UTR與miR-566、miR-1183和miR-1207有結合靶點，且在“弱D”表型樣本中發現miR-566和miR-1183的高表達，初步證明了miR-566和miR-1183能調控RHD基因的表達，為進一步研究調控RHD基因表達的分子機制提供了理論依據。