腹腔感染高毒力肺炎克雷伯菌的臨床與分子特征分析*

王麗萍,邵春紅,范 會,周 正,仝 艷,金 炎△

1.山東省公共衛生臨床中心病原微生物實驗室，山東濟南 250100;2.山東第一醫科大學附屬省立醫院醫學檢驗部，山東濟南 250002

肺炎克雷伯菌(Kpn)是克雷伯菌屬中最重要的一類菌，可誘發重癥肺炎、肝膿腫、肺膿腫和尿路感染等。資料顯示，Kpn已取代大腸埃希菌成為腹腔感染最常見的致病菌[1]。根據毒力特點的不同，可將Kpn分為普通Kpn(cKp)和高毒力Kpn(hvKp)。hvKp因不僅能對健康宿主造成侵襲性感染，還能引起特殊部位的感染，而受到全球關注[2]。為進一步認識hvKp，本研究對腹腔感染hvKp患者的臨床及其分子特征進行分析。現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源 收集山東第一醫科大學附屬省立醫院(以下簡稱本院)2019年1月至2020年10月腹腔感染患者分離的Kpn和其他部位感染分離的Kpn(剔除同一患者分離的重復菌株)，對腹腔感染患者的病歷進行臨床資料總結和分析。Kpn來源患者共84例，其中男54例，女30例；年齡18～86歲，根據拉絲試驗結果分為hvKp組和cKp組，對兩組患者臨床資料進行分析。

1.2儀器與試劑 VITEK MS全自動快速微生物質譜分析儀(法國生物梅里埃有限公司)，VITEK 2 Compact 全自動微生物分析儀及配套藥敏卡(AST-GN13) (法國生物梅里埃有限公司)，TC-96PCR儀(杭州博日科技有限公司)，Power Pac Basi電泳儀(美國伯樂公司)，血平板、麥康凱平板、MH平板、藥敏紙片(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.3方法

1.3.1細菌鑒定及藥敏試驗 采用VITEK MS全自動快速微生物質譜分析儀進行細菌鑒定；采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀(藥敏卡AST-GN13)聯合紙片擴散(K-B)法進行藥敏試驗。藥敏結果參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2019年版標準[3]進行判讀。

1.3.2hvKp菌株篩選 采用黏液表型檢測(拉絲試驗)進行篩選，將凍存菌株用血瓊脂平板轉種，置于CO2恒溫箱，37 ℃培養18～24 h，用滅菌接種針輕放于單個菌落上，慢慢向上挑起菌落，如果有黏液絲形成，且長度≥5 mm，則拉絲試驗陽性，判定為hvKp；反之，則拉絲試驗陰性，判定為cKp[4]。

1.3.3毒力水平檢測 取經過夜培養的hvKp和cKp新鮮菌落，配制成濃度為1×104菌落形成單位(CFU)/mL、1×106CFU/mL、1×108CFU/mL的菌懸液，取每種菌懸液10 μL分別注入大蠟螟尾部的第二和第三對足之間(每個濃度10只)，以注入生理鹽水為對照組，幼蟲在37 ℃孵育4 d，每12 h觀察并記錄大蠟螟的存活情況。

1.3.4血清分型及毒力基因檢測 用煮沸法提取細菌的模板DNA，引物委托上海生工生物工程有限公司合成，血清型引物參照文獻[5-6]，毒力基因引物序列見表1，聚合酶鏈反應擴增后，將陽性產物送至上海生工生物工程有限公司測序，結果在NCBI網站上運用BLAST比對確定其基因型。

表1 莢膜血清分型及毒力基因引物序列

2 結 果

2.1hvKp確認 腹腔感染患者分離的84株Kpn，其中43株拉絲試驗陽性，判定為hvKp，陽性率為51.19%；41株拉絲試驗陰性，判定為cKp。

2.2毒力水平檢測 hvKp和cKp的半數致死量分別為每只大蠟螟1×104CFU/mL和每只大蠟螟1×106CFU/mL，對照組大蠟螟24 h仍然存活，當給菌劑量為1×108CFU/mL時，hvKp組大蠟螟24 h的存活率為58.75%，cKp組大蠟螟24 h的存活率為82.86%，hvKp組與cKp組和對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 毒力水平檢測

2.3血清分型結果 腹腔感染患者分離的Kpn中共30株檢出常見的血清分型，其中以K1型為主，檢出16株(19.05%)，其次為K2型，檢出11株(13.10%)。hvKp組K1型的檢出率高于cKp組(P<0.05)。見表2。

表2 莢膜血清分型比較

2.4毒力基因檢測 腹腔感染患者分離的Kpn中，毒力基因以peg-344和icuA為主(61.90%、54.76%)。hvKp組peg-344、icuA和rmpA的檢出率均高于cKp組(P<0.05)。見表3。

表3 毒力基因分布比較

2.5耐藥性 hvKp和cKp對常用抗菌藥物的耐藥率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，但腹腔感染患者分離的Kpn與同時期本院其他來源的Kpn的藥物敏感率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 抗菌藥物耐藥性比較(%)

2.6臨床特征 hvKP組和cKp組的年齡，住院時間，性別，感染來源，是否入住ICU，生活習慣，臨床診斷(腎膿腫、其他感染)，基礎疾病(高血壓、心臟病)，臨床用藥(除出院帶藥)患者比例比較差異無統計學意義(P>0.05)，而hvKP組臨床診斷中肝膿腫、膽囊感染，基礎疾病中糖尿病、腫瘤和臨床用藥中出院帶藥患者比例均高于cKp組(P<0.05)。見表5。

表5 hvKp與cKp感染患者臨床特征比較

續表5 hvKp與cKp感染患者臨床特征比較

2.7危險因素分析 結合單因素分析結果，將肝膿腫、膽囊感染、糖尿病、腫瘤和出院帶藥作為自變量，hvKp感染作為因變量。多因素Logistic回歸分析結果顯示，糖尿病是hvKp感染的獨立危險因素(P<0.05)，見表6。

表6 hvKp感染多因素Logistic回歸分析

3 討 論

Kpn是引起醫院獲得性感染和社區獲得性感染常見的細菌，可造成多部位感染[7]。hvKp具有高黏性和高致病性[8]。與cKp感染不同的是，其可感染無基礎疾病的年輕人，且易發生轉移感染，導致其他多部位和組織的感染，在臨床受到高度關注。通過大蠟螟毒力水平檢測發現，在相同的給菌劑量下，hvKp組大蠟螟存活率明顯低于cKp組和對照組，在給菌劑量1×108CFU/mL，經過24 h，hvKp組的存活率為58.75%，而對照組仍然全部存活，這顯示了hvKp組的毒力水平較高，印證了hvKp的高毒力性。

腹腔感染患者分離的Kpn以K1型為主，檢出率為19.05%(16株)，其次為K2，檢出率為13.10%(11株)，此外還檢出2株K20和1株K57，未檢出K5和K54。hvKp與cKp兩組比較，K1型檢出率差異有統計學意義(P<0.05)，這與以往研究結果一致[9]，K1型在hvKp感染中最常見，且與肝膿腫密切相關。但本研究共有54株(64.29%)Kpn未檢出常見的血清分型，這說明導致腹腔感染的Kpn可能存在其他血清分型。

毒力基因檢測以peg-344和icuA檢出率較高，其次是rmpA和wabG。hvKp與cKp兩組比較，peg-344、icuA和rmpA檢出率差異均有統計學意義(P<0.05)。rmpA是經質粒介導的細胞外調節多糖因子，能促進Kpn莢膜基因和高黏表型的表達，但有研究發現，rmpA不能獨立發揮作用，必須與碲酸鹽抗性因子、銀抗性因子以及需氧菌素鐵離子復合體受體等共同作用[10]。iucA位于Kpn毒力質粒上，對高毒力表型起至關重要的作用，可作為鑒別hvKp和cKp的遺傳標志物[11]。peg-344是近年來新發現的毒力基因，存在于hvKP毒力質粒上[12]，且有報道顯示，peg-344是hvKp特有的，可用于hvKp快速診斷試驗[5]。單獨以peg-344判定hvKp，其準確度為97%、靈敏度為99%、特異度為96%；單獨以icuA判定hvKp，其準確度為96%、靈敏度為99%、特異度為94%；而二者聯合則準確度可以提高到98%、靈敏度為94%、特異度達100%[5]。此外，還有文獻報道，聯合大蠟螟毒力水平檢測，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值可提高到95.56%、94.83%、93.48%和96.49%[13]。

hvKp對除頭孢唑啉和氨芐西林/舒巴坦外的普通抗菌藥物均表現為100.00%的敏感率，且hvKp較cKp有更高的敏感率，這與SHAH等[9]報道的基本一致，這可能是因為hvKp菌株不能獲得相關的耐藥質粒，或者是某些耐藥基因在普通菌株轉變為高毒力菌株的過程中丟失[8]。雖然本研究未發現多重耐藥或特殊耐藥的菌株，但是近年來報道的產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的hvKp和耐碳青霉烯類的hvKp(cr-hvKp)菌株越來越多，產ESBLs的hvKp是比較重要的耐藥菌株，有更好的傳播效應，而cr-hvKp具有超強毒力、多重耐藥性、傳播性強等特點，給臨床治療帶來更大的挑戰，臨床應加強重視，積極早期治療、預防耐藥菌株的產生[14-15]。

本研究中，hvKP組肝膿腫及膽囊感染患者比例高于cKp組，這可能與hvKp比cKp更容易引起肝膿腫及膽囊感染有關，hvKp感染多以原發性肝膿腫為首要癥狀，這與CUBERO等[16]的研究結果基本一致。經多因素Logistic回歸分析，糖尿病是hvKp感染的獨立危險因素，這主要與糖尿病患者自身免疫功能低下密切相關，與文獻報道一致[17-18]，在高糖的情況下機體的免疫系統易遭到破壞，進而使hvKp莢膜多糖合成能力大大提高，從而使細菌侵襲及抵抗中性粒細胞吞噬的能力得到增強。此外，本研究中，hvKP組腫瘤患者比例高于cKp組，結合臨床資料分析，腫瘤也是hvKp感染的易感因素，這可能與腫瘤患者自身免疫功能低下有關[19]。

由于hvKp耐藥率較低，臨床主要選擇頭孢菌素類抗菌藥物，并且輔以經皮穿刺引流膿液治療，但與cKp感染不同的是，hvKp感染患者中有41.86%的患者出院后帶藥繼續治療，這主要是由于hvKp感染痊愈數周或數月后可能會復發，因此對于hvKp感染患者，可以靜脈輸液治療3～4周后，繼續口服抗菌藥物3～4周以防止復發[18-19]。

現階段臨床診治中并未區分hvKp和cKp感染，但hvKp的高侵襲性及潛在的嚴重后遺癥和耐藥性，在將來可能成為人類健康的重大威脅。雖然hvKp對大部分抗菌藥物敏感，但明確hvKp感染有利于對轉移灶的治療和防止復發，避免出現嚴重后遺癥和高耐藥性菌株。分析本院腹腔感染hvKp的藥物敏感性及臨床特征，可以幫助臨床醫生增加對hvKp的認知，從而為下一步預防及治療提供借鑒。