臭靈丹提取物對肺炎支原體感染小鼠血清細胞因子的影響*

趙若蓮,李云芬,徐 沙,柴 琳

云南中醫藥大學第三附屬醫院檢驗科，云南昆明 650011

肺炎支原體(MP)是一種主要引起上、下呼吸道感染的病原體，其已成為社區獲得性肺炎的首要致病菌之一。MP感染除了引起肺炎支原體肺炎(MPP)外，也可通過免疫機制形成肺外并發癥，可伴發多系統、多器官的損害[1]。MPP的發病機制尚未十分清楚，目前其免疫學機制一直是研究重點。異常的免疫反應及免疫炎癥風暴是造成重癥肺炎和肺外并發癥的主要病因。尤其是細胞因子在MP 感染中的作用越來越受到重視，有研究表明，細胞因子參與了MPP 的發病過程[2]。本課題組前期的研究發現臭靈丹在體外對MP具有抑制作用，因此本研究擬通過研究臭靈丹對MP感染小鼠血清細胞因子的作用，探討臭靈丹在體內對抗MP感染的作用及其可能機制，為深入研究及中醫藥制劑研發提供基礎。

1 材料與方法

1.1材料來源 實驗動物為SPF級4周齡雌性BALB/c小鼠，40只，體質量10～20 g，購自昆明醫科大學實驗動物中心。許可證號SCXK(粵)2014-0035，飼養于溫度25～26 ℃、相對濕度45%～55%的環境中。本研究中飼養及處理方法遵守動物實驗倫理原則。

1.2儀器與試劑 美國貝克曼庫爾特公司離心機，山東新華醫療器械有限公司電熱蒸汽壓力滅菌器，力康生物醫療科技控股有限公司電熱恒溫培養箱，美國BD公司Canto 2流式細胞儀及配套BD(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit，日本奧林巴斯公司BX43顯微鏡。

1.3方法

1.3.1MP培養 MP菌株ATCC29342、MP19(均由昆明醫學生物學研究所贈送)，以上菌體均由本實驗室培養、傳代和凍存，培養基為PPLO培養基，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養10～15 d，傳代過程中采用顏色改變單位(CCU)法定量調整菌體濃度為1×108CCU/mL，-20 ℃冷凍保存備用。

1.3.2臭靈丹提取物制備 取臭靈丹(批號：2010003，購自云南和合中藥飲片有限公司)100 g，采用二次煮沸法進行中藥原液制備，所得藥液最終合并濃縮成100 mL(1 mL原液相當于中藥材1 g)，實驗前用滅菌水在無菌條件下進行倍比稀釋，稀釋終濃度分別為62.5、125.0、250.0 mg/mL，配制好的藥液均存放于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.3小鼠分組與建模 選取40只BALB/c小鼠隨機分為對照組、模型組、低濃度、中濃度和高濃度組，共5組，每組8只。除對照組外，其余組小鼠用乙醚進行麻醉，鼻腔內滴入1×108CCU/mL菌液50 μL，1次/天，共滴鼻5 d，建立MP感染模型。對照組小鼠同等條件下滴入等量生理鹽水。

造模后，低濃度組、中濃度組、高濃度組分別用62.5、125.0、250.0 mg/mL濃度的臭靈丹提取液灌胃，每次0.2 mL，1次/天，連續給藥7 d。對照組與模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。

1.3.4標本采集 灌胃7 d后，于第8天稱量小鼠體質量，之后處死小鼠。處死后分離小鼠左右兩側肺組織，稱取肺濕重，計算肺濕重指數(肺濕重指數=肺質量/體質量×100%)，-80 ℃儲存備用。摘小鼠眼球取血，靜置15 min，3 000×g離心5 min，取上清，-80 ℃儲存備用。

1.3.5蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察肺組織病理變化 取小鼠肺部組織，4%組織固定液固定48 h，洗滌，置于不同的乙醇濃度梯度中脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切4 μm厚片，脫蠟，HE染色，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.3.6流式微球陣列法(CBA)檢測血清細胞因子白細胞介素(IL)-6、IL-10和IL-4水平 CBA檢測小鼠血清細胞因子IL-6、IL-10和IL-4水平，嚴格按照美國BD公司(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit說明書進行操作。

2 結 果

2.1各組小鼠體質量、肺濕重指數比較 與對照組比較，模型組小鼠體質量減輕(P<0.05)，肺濕重指數增加(P<0.05)；與模型組比較，高、低濃度組小鼠體質量增加(P<0.05)，低、中、高濃度組肺濕重指數減低(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 各組小鼠體質量比較

圖2 各組小鼠肺濕重指數比較

2.2各組小鼠肺組織病理情況 對照組肺泡結構清晰，肺泡內無滲出。模型組肺部結構中支氣管周圍的肺間質和/或肺泡腔的肺間質可見輕度水腫，并可見大量淋巴細胞浸潤；支氣管周邊淋巴細胞浸潤更為明顯、更重，支氣管周圍肺泡間隔可見纖維增生，間隔增寬。中濃度組和高濃度組肺組織炎癥浸潤明顯減輕。見圖3。

注：A～E分別為對照組、模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組病理情況。

2.3各組小鼠血清細胞因子水平比較 MP感染小鼠后，模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組血清IL-6水平較對照組升高(P<0.05)，IL-4和IL-10水平較對照組降低(P<0.05)；經不同濃度的臭靈丹提取物作用后，低、中濃度組IL-6水平較模型組降低(P<0.05)；低、中、高濃度組IL-4水平較模型組增高(P<0.05)；低、高濃度組IL-10水平較模型組增高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清IL-4、IL-6和IL-10水平比較

3 討 論

MP感染后宿主免疫系統存在Th1和Th2的細胞免疫失衡[3]，過量炎癥因子釋放，繼而誘發過度免疫反應，從而出現炎癥反應風暴，激發免疫病理損傷。細胞因子刺激機體產生的免疫反應越強，臨床癥狀越重，臟器損傷越明顯。有研究顯示，患難治性MPP的患者，其血清中干擾素-γ(IFN-γ)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平明顯升高[4]。

臭靈丹Laggerapterodonta (DC.) Benth.為菊科六棱菊屬植物，是云南民間特色藥用植物，有抗菌、抗炎、鎮痛、祛痰、抗腫瘤的作用，應用廣泛[5]。本課題組前期的研究發現臭靈丹提取物在體外對MP具有抑制作用，而對于其在體內抗MP感染的作用鮮見報道，因此本研究擬通過觀察臭靈丹對MP感染的小鼠肺部病理改變及血清細胞因子水平的影響來探討其對抗MP感染的作用及其可能的機制。

小鼠感染MP后體質量減輕，肺濕重指數升高，肺部組織出現水腫，淋巴細胞浸潤，纖維增生，間隔增寬等炎性病變。經臭靈丹提取物作用后低濃度組和高濃度組體質量增加，中濃度組體質量變化不明顯，但3組肺濕重指數均較模型組降低，中濃度組和高濃度組肺組織炎癥浸潤明顯減輕。表明不同濃度臭靈丹對小鼠體質量的作用可能不同，其效應和機制有待進一步研究。

IL-6是機體重要的促炎性細胞因子。IL-6在抗感染免疫反應中發揮重要作用，是炎癥反應過程中出現最早、最重要的炎性介質，能誘導B細胞分化和產生抗體，并誘導T細胞活化增殖、分化，參與機體的免疫應答，是炎癥反應的促發劑，其升高水平與感染的嚴重程度相一致[6]。ZHAO等[7]的研究發現，血清IL-6水平在MPP的發病及發展過程中起重要作用，且與感染程度呈正相關。楊璐等[8]和黃梅青等[9]的研究發現，MP感染小鼠模型血清IL-6水平增高，而清燥救肺湯和石仙桃多糖能有效降低IL-6、TNF-α和INF-γ等促炎性細胞因子水平，有助于緩解小鼠肺組織中的炎癥反應。本研究結果顯示，模型組小鼠感染MP后血清IL-6水平升高，經臭靈丹提取物作用后，低濃度組和中濃度組血清IL-6水平降低，而高濃度組IL-6水平升高，表明臭靈丹能減低MP感染引起的過量促炎性細胞因子的釋放，緩解免疫病理損傷，但臭靈丹對MP感染小鼠的血清IL-6水平抑制作用存在有效濃度范圍(中、低濃度)，而超過此范圍的高濃度可能對機體有一定的損傷，該結論有待進一步研究證實。

促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子相互影響,且在感染發展過程中相互影響,對感染的發展方向和結果有重要影響。IL-4和IL-10是為數不多的抗炎性細胞因子，由Th2分泌,對機體有免疫抑制作用[10]。IL-4能下調促炎性細胞因子的分泌，誘導人B淋巴細胞增殖、分化，促進B淋巴細胞合成并分泌免疫蛋白介導體液免疫[11-12]。IL-10 作為抗炎性細胞因子重要成員之一，是強免疫抑制因子，對免疫應答起抑制作用，主要由單核巨噬細胞，T、B淋巴細胞等多種細胞分泌。IL-10主要抑制單核細胞介導的促炎性細胞因子釋放，如IL-6、IL-8、TNF-α等來阻止組織器官受損[13-14]。XU等[15]的研究顯示，MPP患者血清IL-4、IL-10水平降低，且二者水平與間質性肺炎相關。本研究中，模型組小鼠感染MP后血清IL-4和IL-10水平降低，經臭靈丹提取物作用后低濃度組、中濃度組、高濃度組IL-4水平均升高，表明臭靈丹能通過上調抗炎性細胞因子IL-4水平，抑制過量免疫反應及相關炎癥反應，從而減輕機體免疫損傷。低濃度組和高濃度組IL-10水平升高，中濃度組IL-10水平降低，表明臭靈丹對IL-10水平的作用不遵循線性的“作用-劑量關系”，其效應和機制有待擴大樣本量，嚴格控制實驗條件進一步研究。

綜上所述，本研究表明MP 感染后宿主免疫系統存在 Th1 和 Th2 的細胞免疫失衡，臭靈丹能緩解MP感染引起的肺組織炎性病變及過量促炎性細胞因子IL-6釋放，增加抗炎性細胞因子IL-4和IL-10的表達，使Th1 和 Th2 的細胞免疫達到平衡，抑制過度免疫反應，減輕免疫病理損傷，這為研發抗MP感染的相關制劑提供了理論依據和新的思路。