瓜蔞皮注射液中細菌內毒素檢查法的建立

王琪 周建華

（上海上藥第一生化藥業有限公司 上海 200240）

瓜蔞皮注射液為棕黃色的澄明液體，主要成分為瓜蔞皮提取液和注射用水。臨床上主要用于行氣除滿、開胸除痹、痰濁阻絡之冠心病、穩定性心絞痛治療。作為中藥注射劑，其質量標準中未制定細菌內毒素的檢查項。參考《中國藥典》2020版四部9301注射劑安全性檢查法應用指導原則，為加強臨床使用的安全性和制劑質量的可控性，應考慮設細菌內毒素檢查項[1]。

1 材料和方法

1.1 儀器

ET-96細菌內毒素凝膠法測定儀（天津市天大天發科技有限公司）；BET-48G6細菌內毒素測定儀（天津市天大天發科技有限公司）；XW-80A漩渦混旋器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；微量移液器（20～200 μL、100～1000 μL，Eppendorf公司）；無熱原吸咀（250 μL、1000 μL，湛江安度斯生物有限公司）；試驗所用玻璃儀器均經250 ℃干熱滅菌1 h以上。

1.2 試劑

瓜蔞皮注射液（批號1906201、1906202、1906203、1910201、1911201、1912201、2002201、2003201，規格4 mL，上海上藥第一生化藥業有限公司）；細菌內毒素工作標準品（CSE，批號150601-201784，規格80 EU/支，中國食品藥品檢定研究院）；鱟試劑[TAL，批號1903151，規格0.25 EU(0.1 mL)；批號1905241，規格0.125 EU(0.1 mL)；批號1804200，規格10～0.01 EU(1.35 mL)]、細菌內毒素檢查用水（BET，批號1806120，規格5 mL/支）（湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑[TAL，批號1809292，規格0.125 EU(0.1 mL）]、細菌內毒素檢查用水（BET，批號1811160，規格2 mL/支）（湛江博康海洋生物有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌內毒素限值（L）的確定

參照《中國藥典》細菌內毒素限值L計算方法，L=K/M，注射劑K為5 EU/(kg·h)，M為每1 kg體質量每1 h瓜蔞皮注射液最大靜脈滴注劑量（12 mL），人均體質量按60 kg計算，則成人理論L=5/(12/60)=25 EU/mL。依據《中國藥典》2020版四部通則9301注射劑安全性檢查法應用指導原則，限值設定可適當嚴控至計算值的1/3～1/2，而歐美等國常以計算值的1/4作為標準，從使用安全性角度考慮，則將限值設定為＜6.25 EU/mL[1]。

1.3.2 確定最大有效稀釋倍數（MVD）

參照中國藥典最大有效稀釋倍數MVD=cL/λ的計算公式，則c為供試品溶液濃度等于1.0 mL/mL，在凝膠法中λ為鱟試劑的標示靈敏度，最高為0.03 EU/mL，則MVD=1.0×6.25/0.03=208；在動態濁度法中λ為所使用的標準曲線上最低的細菌內毒素濃度0.01 EU/mL，則MVD=1.0×6.25/0.01=625[1]178-181。故確定采用凝膠法時瓜蔞皮注射液的最大有效稀釋倍數為208，采用動態濁度法時則最大有效稀釋倍數為625，驗證時的稀釋倍數不應超過其最大有效稀釋倍數。

1.3.3 凝膠法干擾試驗

1）干擾預實驗 選擇λ=0.25 EU/mL的低靈敏度鱟試劑進行干擾預實驗。取瓜蔞皮注射液用BET制成25、50、100、200倍稀釋濃度的供試品溶液，各濃度取0.1 mL，分別加入鱟試劑0.1 mL，每一濃度平行做2次，作為供試品陰性對照（NPC）；同時用各稀釋倍數下的供試品溶液同比例加入1.0 EU/mL細菌內毒素工作標準品制成含細菌內毒素0.5 EU/mL的溶液，各取0.1 mL，分別加入鱟試劑0.1 mL，每一濃度平行做2次，作為供試品陽性對照（PPC）；另取2支鱟試劑，加入BET水作為陰性對照（NC）；取2支，加入0.5 EU/mL的細菌內毒素工作標準品溶液作為陽性對照（PC），混勻，用封口膜封口，置于凝膠儀中于37 ℃孵育60 min[2-3]。

2）干擾試驗 選擇預實驗下的無干擾稀釋倍數下的供試品溶液和BET，分別將細菌內毒素工作標準品稀釋成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（EU/mL）的系列溶液，用2批來自不同廠家的TAL進行試驗，每一濃度平行做4管[3-4]。同時做陰性對照和供試品對照各2管。λC可根據公式λC＝antilg(∑lgX/n)計算，式中X為反應終點濃度，n為每個濃度的平行管數。

3）樣品細菌內毒素檢查 另取5個不同生產批號的瓜蔞皮注射液，用BET將瓜蔞皮注射液稀釋成由干擾試驗確定的稀釋倍數下的供試液，按《中國藥典》2020版第四部通則1143的方法進行細菌內毒素檢查。

1.3.4 光度測定法——動態濁度法

1）標準曲線可靠性試驗 取1支細菌內毒素標準品，加入1 mL BET水，漩渦15 min，用BET水依次稀釋制成1.0、0.1、0.01 EU/mL系列濃度的標準品溶液，每個濃度平行做3管，并以BET水作為陰性對照，進行自動檢測[2-3]。

2）干擾試驗 根據凝膠法確定的MVD，把瓜蔞皮注射液稀釋50倍后作為供試液，平行做2管；將瓜蔞皮注射液稀釋25倍，與濃度為0.2 EU/mL的細菌內毒素標準品溶液1∶1混合得含細菌內毒素0.1 EU/mL的供試品陽性對照液（稀釋倍數為50倍），平行做2管。

2 結果

2.1 凝膠法干擾試驗

采用TAL 1903151的預實驗結果表明，將瓜蔞皮注射液稀釋50、100、200倍時，2管NPC均為陰性，2管PPC均為陽性，則可認為在這些稀釋倍數下均無干擾；而稀釋25倍時，有時會有干擾（表1）。為操作方便和準確，選擇供試品的最小不干擾稀釋倍數為50，并以此進行干擾試驗。

表1 干擾預實驗

分別使用湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司靈敏度（λ）=0.125 EU/mL的鱟試劑進行干擾試驗。試驗結果表明不同廠家的鱟試劑，鱟試劑λc均在0.5λ～2.0λ（即0.063～0.250 EU/mL）范圍內，鱟試劑靈敏度試驗符合要求，瓜蔞皮注射液在稀釋50倍時，λc亦在0.5λ～2.0λ范圍內，干擾試驗有效，認為供試品在該稀釋倍數下不存在干擾作用（表2）。

表2 瓜蔞皮注射液稀釋50倍后的干擾試驗

依據干擾試驗確定的條件另取5批其他批號的瓜蔞皮注射液進行細菌內毒素檢查，結果均符合規定（表3）。

表3 瓜蔞皮注射液細菌內毒素檢查結果

綜合凝膠法干擾試驗結果，瓜蔞皮注射液按上述實驗條件可確立該樣品的細菌內毒素檢查法。瓜蔞皮注射液稀釋50倍后試驗反應物不干擾，可選擇靈敏度為0.125～0.03 EU/mL的鱟試劑作為日常的凝膠法細菌內毒素檢測[4-5]。

2.2 動態濁度法標準曲線可靠性試驗及干擾試驗

根據試驗結果，標準曲線lgT=2.663 93－0.276 75lgC，相關系數r=－0.999 9，相關系數絕對值大于0.980；陰性對照的反應時間均大于標準曲線最低濃度的反應時間；變異系數均小于10%；供試品陽性對照的細菌內毒素回收率均在50%～200%[6-7]。這些結果表明，標準曲線是可靠的。選用靈敏度為10～0.01 EU/mL的鱟試劑，供試品溶液稀釋至50倍，供試品在此試驗條件下不存在干擾作用，干擾試驗有效（表4）。

動態濁度法的檢測結果表明，3批瓜蔞皮注射液在稀釋了50倍后供試液中細菌內毒素的含量分別為0.008 4、0.014 4 EU/mL及未檢出，折合原液中細菌內毒素含量為0.42、0.72 EU/mL，均小于限值6.25 EU/mL，符合相關規定（表4）。

表4 標準曲線可靠性試驗及樣品干擾試驗

（續表4）

從凝膠法和動態濁度法的干擾試驗結果來看，瓜蔞皮注射液在稀釋50倍后無干擾作用，兩種方法試驗結果一致。兩種方法均可進行瓜蔞皮注射液的細菌內毒素的檢查，日常檢驗可任選其一。

3 討論

類似瓜蔞皮注射液等的中藥制劑，其成分相對復雜，易受到原料產地、生產工藝等干擾因素影響，控制其細菌內毒素對于人體用藥安全有重要意義[8-9]。采用動態濁度法可較為準確地檢測出樣品中真實的細菌內毒素含量，但根據現行中國藥典規定，當測定結果有爭議時，目前尚以凝膠法的結果為準，故本研究建立的兩種方法可為互補。然而，鱟作為國家二級保護動物，堪稱海洋里的遠古遺民，有“生物活化石”之稱，考慮到現在國家對于海洋動物鱟的保護，一些細菌內毒素檢測的新方法也有報道，如重組C因子法等[10]，以減少鱟試劑的使用量。但目前各廠家重組C因子質量差異較大，還須進行深入的研究才能作為國標用于注射液的細菌內毒素檢測。