抑制Polo樣蛋白激酶1聯合細胞因子誘導的殺傷細胞對三陰性乳腺癌殺傷效應的機制初探

勵 超 錢 飚 魯洪豐 李旭軍

中國科學院大學寧波華美醫院乳腺外科，浙江寧波 315000

三陰性乳腺癌（triple–negative breast cancer，TNBC）是女性最常見的惡性腫瘤之一，作為復雜的疾病類型，其表現出明顯的腫瘤間和腫瘤內異質性[1,2]。研究表明，晚期乳腺癌通?？赊D移到骨、肝、肺和腦等遠處器官[3]，優化當前乳腺癌的臨床治療方法以尋找新型診療方案仍是目前的研究熱點。Polo樣蛋白激酶1（Polo–like kinase1，PLK1）是PLK 家族成員之一，是一類廣泛存在于真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶?，F已知PLK1 在大多數腫瘤中高度表達，如骨肉瘤、非小細胞肺癌和乳腺癌等，并與患者的腫瘤細胞增殖和預后密切相關[4-6]。此外，通過抑制PLK1 免受蛋白酶體降解能夠促進乳腺癌細胞增殖，提示PLK1 可能是治療乳腺癌的潛在靶點[7]。目前，隨著對腫瘤發生發展機制和現代生物技術的深入探索，自體免疫細胞療法對腫瘤治療發揮重要作用，其中，細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine–induced killer cell，CIK 細胞）是用于免疫治療的常見免疫效應細胞，可介導腫瘤細胞凋亡或導致細胞死亡，并分泌相關細胞因子以促進抗腫瘤作用，具有殺瘤活性高和識別能力強等優點[8]。鑒于此，本研究旨在探究抑制PLK1 表達聯合CIK 細胞作用下對乳腺癌細胞的影響，以期為該疾病的治療提供新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級BALB/c 裸鼠40 只，雌性，4～6 周齡，體質量18～20g，飼養室溫度22～24℃、相對濕度（50±5）%且每日光照/黑暗交替12h，飼養環境經嚴格滅菌處理，期間自由飲水與攝食，適應性飼喂1 周后開始實驗。本研究獲得醫院動物倫理委員會審批通過（批件號：SL–NBEY–KY–2022–045–03）。

1.1.2 細胞 TNBC細胞株MDA–MB–231購于美國典型培養物保藏中心。

1.1.3 主要試劑 PLK1 抑制劑BI–2536 購于美國Selleck 公司，γ 干擾素（interferon–γ，IFN–γ）購于美國PeproTech 公司，白細胞介素–2（interleukin 2，IL–2）購于北京四環生物制藥有限公司，CD3McAb購于美國Corning 公司，MTT 試劑盒和蘇木精–伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE 染色）試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司，Annexin V–FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，PVDF 膜購于美國Millipore公司，蛋白裂解液、BCA 蛋白檢測試劑盒及ECL 增強化學發光液購于上海碧云天生物研究所，免疫組織化學染色（DAB 顯色）試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司，PerCP–CD3、FITC–CD4、APC–CD8、FITC–CD56 抗體及兔抗人Ki–67 多克隆、兔抗人胱天蛋白酶（caspase）–3、兔抗人caspase–9、兔抗人GAPDH 多克隆抗體購于英國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 CIK 細胞的培養、擴增及鑒定 收集健康志愿者（倫理號：SX–NBEY–TY–2022–122–12）外周靜脈血30ml 置于肝素抗凝管，Ficoll 密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，置于37℃、5% CO2孵箱內培養，收集細胞，加入含1000U/ml INF–γ 與20%人血清白蛋白的無血清培養基，在孵箱內培養。24h后加入400U/ml IL–2 和50 ng/ml CD3McAb 繼續培養，每隔2d 換液1 次，同時補足1000 U/ml IL–2。分別取分離的外周血單個核細胞和誘導培養第12 天的CIK 細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，以1000 轉/min 離心5min，調整細胞濃度為5×106個/ml，取100μl 細胞懸液置于干凈離心管，分別加入PerCP 熒光標記的CD3、FITC熒光標記的CD4、APC 熒光標記的CD8、FITC 熒光標記的CD56 抗體，充分混勻后，4℃避光靜置30min，PBS 洗滌2 遍，加入4%多聚甲醛固定液重懸沉淀，應用流式細胞儀檢測分析。

1.2.2 MTT法 將MDA–MB–231細胞添加至含10%胎牛血清和1%青–鏈霉素的DMEM 培養基，置于37℃、5%CO2孵箱中培養貼壁后，常規傳代培養。通過BI–2536、CIK 細胞及BI–2536 聯合CIK 細胞處理MDA–MB–231 細胞后，檢測各處理組細胞存活率。①BI–2536 對MDA–MB–231 細胞存活率的影響：將對數生長期的MDA–MB–231 細胞用0.25%胰酶消化，制備成單細胞懸液，以1×103個/孔的密度植入96 孔培養板，在孵箱培養24h 后，分別換用含1、2.5、5、10、20μmol/L BI–2536 的培養基培養48h 后，每孔加入20μl MTT（5mg/ml）繼續培養4h，棄原液，加入150μl DMSO 至細胞孔，充分振蕩，待孔內藍紫色結晶全部溶解后，采用酶標儀檢測各細胞孔A490值，計算各組細胞存活率。②CIK 細胞對MDA–MB–231細胞存活率的影響：將消化后的MDA–MB–231 細胞調整密度至1×104個/ml 作為靶細胞，將CIK 細胞調整細胞密度至5×105個/ml 作為效應細胞；依次按照5∶1、10∶1、20∶1、40∶1 的效靶比例將CIK 細胞與MDA–MB–231 細胞共植入96 孔培養板，將培養板置于37℃、5%CO2孵箱內培養48h 后，根據MTT 法檢測各細胞孔A490值，計算各組細胞存活率。③BI–2536 聯合CIK 細胞對MDA–MB–231 細胞存活率的影響：將消化后的MDA–MB–231 細胞以1×103個/孔的密度植入96 孔培養板，設置對照組、BI–2536 組（5μmol/L BI–2536 處理MDA–MB–231 細胞48h）、CIK組（效靶比為10∶1的CIK細胞處理MDA–MB–231細胞48h）、BI–2536+CIK 組（5μmol/L BI–2536 與效靶比為10∶1的CIK細胞共同處理MDA–MB–231細胞48h），處理完成后，根據MTT 法檢測各細胞孔A490值，計算各組細胞存活率。

1.2.3 流式細胞術 取1.2.2 ③處理后的各組MDA–MB–231 細胞，PBS 洗滌，0.25%胰酶消化，PBS 再洗滌后，使用染料結合緩沖液重懸制備成單細胞懸液，調整細胞密度為2×105個/ml，取100μl 細胞懸液移入干凈離心管，依次加入5μl Annexin V–FITC 和5μl PI，渦旋混勻，室溫避光孵育10min 后，通過流式細胞儀上機檢測各組細胞凋亡水平。

1.2.4 蛋白質印跡法 通過蛋白裂解液提取各組MDA–MB–231 細胞的總蛋白，BCA 法蛋白定量后，加入SDS 上樣緩沖液，沸水浴處理5min，制備12% SDS–PAGE 凝膠，將蛋白樣品加入凝膠孔內，電泳分離蛋白，以220mA、120min 轉膜條件電轉印至PVDF 膜，并置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1h。分別加入稀釋的一抗caspase–3（1∶1000）和caspase–9（1∶1000），4℃孵育過夜；次日，TBST 室溫洗膜，再加入稀釋的對應二抗（1∶5000），室溫孵育1h，TBST 洗膜，將膜采用ECL 增強化學發光顯影，暗室曝光，以GAPDH 作為內參，利用ImageJ 1.8.0 軟件計算各蛋白相對表達水平。

1.2.5 裸鼠移植瘤模型的建立與分組處理 將正常培養的MDA–MB–231 細胞密度調整為1×108個/ml，將BALB/c 裸鼠右下腹部消毒，通過微量注射器取200μl 細胞懸液推注于裸鼠右側腋窩處，夾緊針孔以防滲漏。接種后，每日觀察裸鼠生長狀態與腫瘤長出情況。待瘤體生長達到約100mm3時，選擇32 只瘤體大小與形態較為一致的裸鼠，按數字表法隨機分成4組，每組8 只。①對照組：與給藥組等容積的生理鹽水灌胃，尾靜脈注射200μl 生理鹽水；②BI–2536 組：以10mg/kg BI–2536（溶于含30%PEG–400、0.5%Tween–80和5%丙烯的生理鹽水）灌胃，每2d 一次；③CIK 組：取200μl CIK 細胞（1×106個/ml）進行尾靜脈注射，一周2 次；④BI–2536+CIK 組：以10mg/kg BI–2536灌胃，每2d 一次，并取200μl CIK 細胞（1×106個/ml）進行尾靜脈注射，一周2 次。持續觀察各組裸鼠腫瘤生長，用游標卡尺測量瘤體，每隔2d 測量一次；21d后處死所有裸鼠，無菌環境下解剖取出瘤體，清洗干凈后電子天平稱重，將一部分組織固定在10%福爾馬林中，一部分置于液氮迅速冷凍后保存于-80℃冰箱。

1.2.6 HE染色 取10%福爾馬林中固定好的裸鼠移植瘤組織，常規脫水透明，制備成石蠟塊，在切片機上連續切成4μm 的組織切片，將其以二甲苯脫蠟與梯度酒精脫水處理后，置于Harris 蘇木精中染色5min，流水沖洗干凈，在切片上滴入1%鹽酸/乙醇分化數秒，沖洗干凈后，加入伊紅染色3min，再經過脫水、透明處理，中性樹膠封固，在光學顯微鏡下觀察各腫瘤組織內腫瘤細胞生長狀況，并攝取圖像。

1.2.7 免疫組織化學染色 將制備的腫瘤組織切片在烤箱高溫處理1h，常規脫蠟水化，滴加檸檬酸鈉加熱修復抗原，0.3%過氧化氫液室溫孵育10min，PBS 沖洗浸泡，組化筆畫圈標記，10%山羊血清室溫封閉，分別滴加稀釋后的兔抗人Ki–67 多克隆抗體（1∶100）、兔抗人caspase–3 多克隆抗體（1∶200）和兔抗人caspase–9 多克隆抗體（1∶200），4℃冰箱內孵育過夜；次日，棄原液，PBS 沖洗后，圈內滴加稀釋后的對應二抗（1∶5000），室溫繼續孵育1h。再次洗滌切片后，利用DAB 進行顯色，流水沖洗，蘇木精復染，常規脫水透明，中性樹膠封固，通過光學顯微鏡觀察組織內細胞著色情況并拍攝圖像，胞質、胞核染為棕色至棕褐色為陽性，隨機選擇5 個視野，通過ImageJ 1.8.0 軟件分析蛋白陽性染色面積，以陽性染色面積與總面積之比表示各蛋白的陽性表達率。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件分析處理實驗數據，GraphPad Prism 8.30 繪制統計圖。計量資料以均數±標準差（）表示，所有實驗至少進行3 次。采用單因素方差分析進行多組重復測量數據比較，LSD–t檢驗進行組內兩兩數據比較。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIK 細胞鑒定

與誘導前比較，CIK 細胞經過14d 體外誘導擴增后，CIK 細胞亞群中CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞比例均顯著增加（P<0.05），而CD3+CD4+細胞比例顯著減少（P<0.05），見圖1。

圖1 流式細胞術檢測CD3+CD8+、CD3+CD56+ 及CD3+CD4+細胞比例

2.2 抑制PLK1 及CIK 細胞對TNBC 細胞的增殖抑制

與對照組比較，隨著藥物濃度的增加，細胞存活率明顯下降，呈劑量依賴性，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2A。不同效靶比的CIK 細胞作用于MDA–MB–231 細胞后，細胞存活率隨著效靶比的增加而降低，呈效靶比依賴性，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2B。

圖2 MTT 法檢測各組MDA–MB–231 細胞存活率

2.3 抑制PLK1 聯合CIK 細胞對TNBC 細胞的增殖抑制作用

與對照組比較，BI–2536 組和CIK 組的MDA–MB–231 細胞存活率均顯著下降（P<0.05）；而與BI–2536 組和CIK 組比較，BI–2536+CIK 組的細胞存活率進一步顯著下降（P<0.05），見圖3。

圖3 MTT 法檢測各組的MDA–MB–231 細胞存活率

2.4 抑制PLK1 聯合CIK 細胞對TNBC 細胞凋亡的影響

BI–2536 組和CIK 組的MDA–MB–231 細胞凋亡率均顯著高于對照組（P<0.05）；BI–2536+CIK 組的細胞凋亡率顯著高于BI–2536 組和CIK 組（P<0.05），見圖4。

圖4 流式細胞術檢測各組的MDA–MB–231 細胞凋亡率

2.5 抑制PLK1 聯合CIK 細胞對TNBC 細胞中caspase–3 與caspase–9 蛋白表達的影響

與對照組比較，BI–2536 組和CIK 組的MDA–MB–231 細胞中caspase–3、caspase–9 蛋白活性均顯著增加（P<0.05）；與BI–2536 組和CIK 組比較，BI–2536+CIK 組細胞中caspase–3、caspase–9 蛋白活性均進一步顯著增加（P<0.05），見圖5。

圖5 蛋白質印跡法檢測各組中的MDA–MB–231 細胞中的caspase–3 與caspase–9 蛋白水平

2.6 抑制PLK1 聯合CIK 細胞對TNBC 裸鼠移植瘤生長的影響

在第6、9、12、15、18、21 天時，BI–2536 組和 CIK 組裸鼠腫瘤組織體積顯著小于對照組（P<0.05），而相較于 BI–2536 組和 CIK 組，BI–2536+CIK 組裸鼠腫瘤組織體積進一步顯著縮?。≒<0.05），見圖6A。與對照組比較，BI–2536 組和 CIK 組裸鼠腫瘤質量顯著減少（P<0.05），BI–2536+CIK 組的腫瘤組織質量顯著小于BI–2536組和CIK 組（P<0.05），見圖6B、圖6C。

圖6 各組裸鼠腫瘤組織體積與質量測定

2.7 抑制PLK1 聯合CIK 細胞對TNBC 裸鼠腫瘤組織內細胞生長的影響

通過HE 染色觀察到對照組裸鼠腫瘤組織內染色均勻，細胞排列密集，生長狀態良好；相較于對照組，BI–2536 組和CIK 組裸鼠腫瘤組織內細胞排列較為稀疏，數目明顯減少；而與BI–2536 組和CIK組比較，BI–2536+CIK 組裸鼠腫瘤組織內細胞進一步減少，且形態不規則，見圖7。

圖7 各組大鼠腫瘤組織內細胞生長（HE 染色，×100）

Ki–67 蛋白陽性表達主要位于細胞核，caspase–3和caspase–9 蛋白陽性表達主要位于細胞質，部分定位于細胞核，呈彌漫分布。與對照組比較，BI–2536組和CIK 組裸鼠腫瘤組織內Ki–67 陽性率顯著減少（P<0.05），caspase–3 陽性率和caspase–9 陽性率均顯著增加（P<0.05）；而與BI–2536 組和CIK 組比較，BI–2536+CIK 組裸鼠腫瘤組織內Ki–67 陽性率顯著減少（P<0.05），caspase–3 陽性率和caspase–9陽性率則均顯著增加（P<0.05），見圖8。

圖8 各組腫瘤組織內Ki–67、caspase–3 及caspase–9 表達

3 討論

乳腺癌作為一種高度異質性的疾病，不同患者的臨床治療和預后差異較大?；诨蚧钚詸z測已確定10 余個不同的疾病亞型，TNBC 是一種特定的乳腺癌亞型，不表達雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor 2，HER2），臨床特征表現為侵襲性強、轉移潛能高、易復發和預后差[9]。由于TNBC 缺乏ER、PR 和HER2表達，對內分泌治療不敏感且缺乏有效的治療靶點，目前尚無標準化的TNBC 治療方案。因此，開發新型TNBC 治療策略迫在眉睫。

PLK1包含保守的N末端激酶催化域和Polo–box結構域，參與磷酸化的激活與亞細胞定位調節。PLK1幾乎調節細胞分裂的各個階段，此外，其還在調節微管動力學、染色體動力學、p53 活性、DNA 復制和損傷修復等方面發揮重要作用。目前，已揭示PLK1 在多種腫瘤中存在過表達現象，其表達水平與細胞增殖、轉移和不良預后有關[4-6,10]。Maire 等[11]研究發現TNBC 中PLK1 的表達水平高于乳腺癌A型、B 型和HER2 過表達型，提示PLK1 是TNBC的潛在治療靶點；Ren 等[12]研究表明PLK1 能促進TNBC 腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和克隆形成，是TNBC 發生過程中的關鍵Hub 基因，推動乳腺癌惡性進展。鑒于此，研究者認為以PLK1 作為治療靶點開發藥物對個體化 TNBC 治療具有很大前景。BI–2536 是PLK1 的ATP 結合域抑制劑，可在低納摩爾濃度下與PLK1 的激酶域結合并抑制其活性，使腫瘤細胞有絲分裂和周期進程異常，進而抑制腫瘤發生發展[13]。本研究結果顯示，經過不同劑量BI–2536 處理MDA–MB–231 細胞后，隨著藥物濃度的增加，細胞存活率明顯下降；此外，BI–2536作用于移植瘤裸鼠后其腫瘤體積和質量均減小，腫瘤組織內細胞生長與增殖均受抑制，由此說明BI–2536 對體內外乳腺癌腫瘤細胞生長均表現出抑制作用。

CIK 細胞是從人外周血單核細胞中收獲的異質免疫效應細胞，經幾種細胞因子誘導而來，對腫瘤細胞顯示出廣泛的主要組織相容性復合體非限制性殺瘤活性，能夠通過釋放穿孔素、顆粒酶B、細胞溶解素等殺傷腫瘤細胞[8]。與其他免疫細胞相比，CIK細胞具有增殖能力強、抗腫瘤譜廣及抗腫瘤活性強等特點。然而，CIK 在治療TNBC 中仍面臨諸多問題，由于TNBC 惡性程度高且轉移快速，部分患者在確診時已處于晚期，此時患者的免疫功能較低，激活抗腫瘤免疫反應的能力差，且由于腫瘤組織已建立免疫抑制環境，使得CIK 細胞難以發揮作用[14]。近年來，一些基礎研究和臨床研究都強調CIK 細胞與其他化療藥物、靶向藥物或免疫療法相結合，能夠獲得有效而持久的抗腫瘤效果。Chen 等[15]研究表明，卡培他濱節拍化療聯合自體CIK 細胞免疫療法對治療復發轉移性TNBC 有效，可提高患者的免疫功能和生活質量，并延長無進展生存期；Li 等[16]研究揭示CIK 細胞免疫治療與TNBC 預后之間的關系，表明CIK 細胞免疫治療可提高TNBC 患者常規化療的效果，且不良反應較少；孔娟等[17]研究說明CIK細胞聯合腫瘤靶向藥物西妥昔單抗對表皮生長因子受體陽性的野生型結直腸癌細胞與突變型結直腸癌細胞均顯示出較強的殺傷效應。本研究中，通過將CIK 細胞與PLK1 抑制劑BI–2536 聯合作用于體外MDA–MB–231 細胞后發現，聯合作用下的腫瘤細胞活性更低，細胞凋亡率更高，體內乳腺癌裸鼠移植瘤實驗結果也顯示出CIK 細胞聯合BI–2536 作用下的瘤體生長進一步減緩，抑瘤作用更強。由此推測，CIK 細胞聯合PLK1 抑制劑BI–2536 可增強對腫瘤細胞的殺傷作用。

Caspase 是一個進化保守的半胱氨酸蛋白酶家族，主要參與細胞死亡和炎性反應，是由大小不一的氨基末端結構域和約20kDa、10kDa 的大、小催化亞基所組成的蛋白酶結構域，共包含15 個家族成員，其中caspase–3 是一種典型的凋亡執行者，在被啟動子caspase–9 激活后裂解細胞內多個具有關鍵功能的蛋白質，從而導致細胞凋亡。目前，許多抗癌療法，包括細胞毒性藥物、放射療法或免疫療法，都能夠通過激活caspase–3 來誘導腫瘤細胞凋亡或死亡[18,19]。本研究結果顯示，經CIK 細胞聯合BI–2536 處理的MDA–MB–231 細胞中caspase–3、caspase–9 蛋白活性均增加，同時，乳腺癌移植瘤裸鼠腫瘤組織內也表現出caspase–3、caspase–9 蛋白表達增加的現象，提示CIK 細胞聯合BI–2536 可通過進一步誘導caspase 依賴性途徑促進腫瘤細胞凋亡，進而發揮抑制腫瘤發展的作用。

綜上，使用PLK1 抑制劑BI–2536 聯合CIK 細胞能夠在體內和體外增強對TNBC 腫瘤細胞的殺傷作用，該作用機制可能與進一步激活caspase 依賴性途徑相關。靶向抑制PLK1 與CIK 細胞的聯合應用有可能成為一種新型有效的抗腫瘤治療方案用于TNBC 的臨床應用中。