組蛋白去乙酰基化酶及其抑制劑在卵巢癌中的應用*

江蘭蘭 綜述 ，高 軍 審校

(1.南昌大學第三附屬醫院婦產科，南昌 330006；2.南昌大學江西醫學院研究生部，南昌 330006；3.江西省南昌市婦科腫瘤精準治療重點實驗室 330006)

卵巢癌是婦科最常見惡性腫瘤之一，死亡率最高，全世界每年有近18.5萬人死于卵巢癌[1]。因早期缺乏特異性篩查手段，導致最初診斷已是癌癥晚期。其是一種異質性腫瘤，包括超過15種腫瘤類型和基于組織學特征的亞型，2/3的卵巢癌患者被診斷為高級別漿液性腫瘤[2]。卵巢癌的常規治療為腫瘤細胞減滅術，以及以鉑類為基礎的輔助化療為主。盡管近幾十年來卵巢癌患者存活率有所提高，但仍有2/3的患者在確診后10年內死亡。在被診斷為晚期侵襲性上皮性卵巢癌的婦女中5年生存率低于20%[3]。所以，有關卵巢癌的研究一直備受關注。

過去的研究發現，表觀遺傳異常可能是癌癥的標志之一，已被大家所知悉。如組蛋白的翻譯后修飾可能通過調節基因轉錄、染色質重塑和核結構在癌癥的發生和發展中發揮關鍵作用。組蛋白乙酰化是一種被廣泛研究的翻譯后組蛋白修飾，由組蛋白乙酰化轉移酶和組蛋白去乙酰基化酶(histone deacetylases，HDAC)的相反活性控制。通過去除乙酰基逆轉染色質乙酰化，可改變癌基因和抑癌基因的轉錄。此外，HDAC還參與了包括癌癥發生和發展在內的廣泛的生物學過程。現將HDAC及HDAC抑制劑(histone deacetylase inhibitors，HDACI)在卵巢癌中的應用綜述如下。

1 HDAC與卵巢癌的發生和發展

HDAC基于與酵母的序列同源性可分為4類，分別為Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ類。Ⅰ類HDAC主要包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8等；Ⅱ類HDAC進一步分為2個亞類，Ⅱa類(HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9)和Ⅱb類(HDAC6、HDAC10)；Ⅲ類HDAC主要有SIRT1～7；Ⅳ類HDAC只包含HDAC11。

Ⅰ類HDAC表達于全身組織和器官中，主要位于細胞核，其過度表達與卵巢癌的發生和發展密切相關。在惡性卵巢腫瘤、交界性卵巢腫瘤、良性卵巢腫瘤中HDAC1的陽性表達率分別為90%、60%、20%，而HDAC1在正常卵巢組織中不表達；在卵巢惡性腫瘤組中HDAC1的表達與分化程度呈負相關(r=-0.53,P=0.01)，且在低分化組中的表達顯著高于中、高分化組，差異均有統計學意義(P<0.05)；但與患者年齡、術前血清癌抗原125水平、臨床分期和病理類型無關[4]。使用針對HDAC1、HDAC2、HDAC3的小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)對特定亞型HDAC卵巢癌細胞株SKOV3、OVCAR3、IGROV-1、ES-2、TOV112D、A2780、A2780/CDDP的影響分析表明，HDAC1的敲除顯著降低了卵巢癌細胞的增殖，而HDAC3的敲除則減少了細胞的遷移[5]。有研究發現，siRNA沉默卵巢癌SKOV3細胞HDAC1，轉染HDAC1 siRNA的SKOV3細胞HDAC1 mRNA和蛋白水平均明顯降低，說明體外構建的HDAC1 siRNA能有效下調SKOV3細胞HDAC1基因的表達；HDAC1基因表達下調后SKOV3細胞遷移能力和侵襲能力均顯著降低[6]。微小RNA-34a(miR-34a)可通過直接結合和下調HDAC1表達對卵巢癌細胞表現出抑制作用，隨后降低了對順鉑的耐藥性并抑制了卵巢癌細胞的增殖[7]。同樣，有研究發現，在順鉑耐藥的A2780CDDP細胞、A2780CDDP卵巢癌異種移植物的小鼠中，通過下調癌基因c-Myc和上調miR-34a，siRNA下調HDAC1基因可抑制細胞增殖，增加細胞凋亡和化療敏感性；用siRNA沉默HDAC1使c-Myc表達減少，miR-34a表達增加，并使A2780細胞對順鉑誘導的細胞凋亡敏感[8]。DU等[9]發現，泛素特異性蛋白酶5(ubiquitin specific peptidase 5，USP5)可能通過抑制HDAC2的泛素化而上調其蛋白水平，下調p27的表達，從而導致卵巢癌的進展。miR-455-3p在多種腫瘤中低表達，作為抑癌基因參與調控各種生物進程,其靶向HDAC2具有誘導卵巢癌細胞HO-8910凋亡，抑制細胞增殖、侵襲和遷移，降低運動能力等作用[10-11]。

Ⅱ類HDAC分為2個亞類，近年來，與Ⅰ類HDAC比較，Ⅱ類HDAC在卵巢癌方面的研究相對較少。有研究表明，miR-370-3p通過靶向下調HDAC4抑制卵巢癌細胞的生長，并改變卵巢癌細胞的代謝[12]。HDAC4和缺氧誘導因子1-α(hypoxia inducible factor-1-α，HIF1-α)的過表達和胞漿轉位均可促進自噬和抗凋亡過程，并介導p53和鼠類肉瘤病毒癌基因(rat sarcoma viral oncogene，RAS)突變體通過、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl2)、自噬相關蛋白3(Autophagy Related 3，ATG3)、自噬相關蛋白12(Autophagy Related 12，ATG12)的失調不同地控制細胞的凋亡和自噬，從而抑制或促進化療耐藥[13]。有學者發現，HDAC6使AT富集作用在1號染色體(AT-Rich Interaction Domain 1A，ARID1A)突變的卵巢癌細胞上調，然后直接去乙酰化翻譯后修飾促進凋亡的p53K120Ac，而p53K120Ac是HDAC6的底物，表明ARID1A突變在功能上使p53失活，從而抑制癌細胞凋亡[14]。有研究進行的單變量分析HDAC6染色強度與總生存期(overall survival，OS)的Kaplan-Meier生存曲線結果顯示，低HDAC6水平與較差的OS顯著相關，差異有統計學意義[危害比(hazard ratio，HR)=0.38，95%可信區間(95%confidence interval，95%CI)：0.16～0.88，P=0.02]；調整分期、分級和細胞減少術/細胞減少術的多變量Cox回歸模型分析結果顯示，低HDAC6水平與OS仍顯著相關，差異有統計學意義(HR降低0.19%，95%CI：0.06～0.549，P=0.002)。此外，低表達HDAC6腫瘤患者與高表達HDAC6腫瘤患者比較，HDAC6 mRNA水平OS也顯著相關，差異有統計學意義(合并HR=0.88，95%CI：0.78～0.99；P=0.04)，表明低HDAC6 mRNA表達與降低生存風險有關[15]。然而對 HDAC10在癌癥治療中所扮演的角色，有研究發現，HDAC10在卵巢癌細胞中呈低表達，甚至無表達；抑制HDAC10的表達及HDAC10缺失均可提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[16]。

Ⅲ類HDAC主要包含SIRT1-7，在這7個去乙酰化酶中，SIRT1是人類癌癥中研究最多的，在許多惡性腫瘤中均扮演著雙重角色，包括卵巢癌。ZENG等[17]利用數據庫及相關統計學方法分析了Sirtuins家族在卵巢癌患者中的轉錄表達和預后意義，結果顯示：(1)采用基因表達譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)檢測卵巢癌組織和健康卵巢組織中SIRT mRNA相對水平發現，與健康卵巢組織比較，卵巢癌組織中SIRT1、SIRT2、SIRT3 mRNA水平顯著降低，SIRT1、SIRT3 mRNA水平與文獻報道的蛋白水平相符。其他SIRT在卵巢癌和健康卵巢組織mRNA、蛋白表達均沒有差異。此外，其還研究了SIRT在卵巢癌不同階段的表達情況，結果顯示，SIRT1、SIRT5 mRNA水平在不同腫瘤分期中有顯著變化，而其余的SIRT表達無差異。(2)采用Kaplan-Meier繪圖儀評估SIRT水平在所有卵巢癌患者中的預后作用發現，高SIRT3、SIRT5、SIRT6、SIRT7 mRNA水平與良好的OS顯著相關，而高SIRT1、SIRT4水平與較差的OS相關。此外，SIRT2、SIRT6、SIRT7 mRNA水平升高或SIRT1、SIRT4、SIRT5水平降低均與良好的無進展生存期(PFS)相關。上皮向間充質轉化極大地促進了癌細胞的擴散，其特征是上皮標志物的丟失和間質標志物的獲得，從而使細胞更具遷移性和侵襲性。有研究發現，SIRT1可調節卵巢癌細胞上皮標志物基因——CLDN5的轉錄，Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4 ，KLF4)是一種已知的CLDN5轉錄激活因子，SIRT1的脫乙酰基促進了KLF4的核積累，并增強了KLF4與細胞核內CLDN5啟動子的結合，從而促進了卵巢癌細胞的侵襲和遷移[18]。相反SIRT1又可通過抑制卵巢癌上皮-間充質轉化而抑制細胞遷移和侵襲，以及miR-506-3p通過靶向SIRT1/蛋白激酶B /叉形頭轉錄因子O3a(Forkhead box O3a，FOXO3a )信號傳導途徑抑制卵巢癌細胞的增殖及促進凋亡[19-20]。

Ⅳ類HDAC僅包含HDAC11一種。HDAC11主要在平滑肌、心臟、腎臟和腦組織中表達,而在其他組織表達水平不高[21]。ZHOU等[22]利用Kaplan-Meier繪圖儀綜合研究了卵巢癌患者11種HDAC亞型mRNA表達的評估預后的價值發現，HDAC3、HDAC6、HDAC9 mRNA表達與卵巢癌患者OS、PFS無關。此外，HDAC7、HDAC8、HDAC10 mRNA高表達與卵巢癌患者良好OS和不良PFS顯著相關。而HDAC1、HDAC2、HDAC4、HDAC5、HDAC11 mRNA表達與卵巢癌患者不良OS和PFS相關。值得注意的是，其中HDAC11在漿液性/Ⅲ期+Ⅳ期/Ⅲ級/TP53突變卵巢癌患者中均顯示出不良OS和PFS。一項來自150例Ⅲ、Ⅳ期卵巢上皮癌患者(不包括透明細胞癌和黏液細胞癌患者及細胞減少術后接受化療者)的樣本及癌癥基因組圖譜描述的311例高級別晚期系列腫瘤樣本的數據顯示，HDAC11啟動子區甲基化與卵巢癌患者的不良預后相關[23]。

2 HDACIs在卵巢癌中的應用

HDAC使組蛋白去乙酰化，染色質卷縮，抑制轉錄，沉默抑癌基因，抑制細胞內多種信號通路、凋亡相關基因及細胞黏附轉移相關基因表達，促進腫瘤發生、發展和轉移。HDACIs抑制HDAC活性，使染色質松弛，解除對抑癌基因轉錄的抑制，促進抑癌基因表達，抑制癌細胞增殖，促進凋亡。HDACIs分為4類，分別為羥肟酸類、短鏈脂肪酸類、環狀四肽類和苯酰胺類，其中羥肟酸類是目前被研究最多的一類。

2.1 異羥肟酸類

異羥肟酸類HDACI是近年來研究較為廣泛的一類HDACI，其組成主要包括環、脂肪鏈和羥肟酸，分別為表面識別區、連接區和金屬結合區(鋅結合區)，主要有Panobinostat、SAHA、曲古抑菌素、Belinostat等。Panobinostat能選擇性地抑制癌細胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ類HDAC活性，對癌細胞具有較高選擇性。有研究表明，Panobinostat能抑制卵巢癌細胞增殖并誘導G2/M細胞周期阻滯、凋亡和自噬；Panobinostat與避免自噬機制的自噬抑制劑——氯喹聯合應用對4株卵巢癌細胞(IGROV-1、OVCAR-8、SKOV3、A2780)的體外作用時，具有很強的協同作用，氯喹增加了導致DNA雙鏈斷裂(DSB)的活性氧物種，而Panobinostat通過避免同源修復重組酶51(RADiation sensitive 51，RAD51)正確地募集到DSB而抑制其修復，從而抑制卵巢癌細胞增殖，誘導細胞凋亡[24]。BANDOLIK等[25]在探索HDACi在高級別漿液性卵巢癌中提高鉑效力的潛力時分別用順鉑、Entinostat、Panobinostat、nexturastat A聯合作用于4株對順鉑敏感性不同的高級別漿液性卵巢癌細胞(CAOV3、HEY、Kuramochi、OVSAHO)及A2780細胞，結果顯示，單獨使用順鉑治療組A2780細胞的半數抑制濃度(IC50)為11.0 nmol，CAOV3細胞的IC50為1.44 nmol，HEY細胞的IC50為5.25 nmol，Kuramochi細胞的IC50為4.68 nmol，OVSAHO細胞的IC50為4.83 nmol；Panobinostat聯合順鉑治療組A2780細胞的IC50為2.58 nmol，CAOV3細胞的IC50為0.74 nmol，HEY細胞的IC50為2.75 nmol，Kuramochi細胞的IC50為5.14 nmol，OVSAHO細胞的IC50為3.01 nmol。表示Panobinostat能顯著提高4株高級別漿液性卵巢癌細胞中的2株(HEY、OVSAHO)和A2780細胞對順鉑的敏感性。

2.2 短鏈脂肪酸類

短鏈脂肪酸類HDACI結構比較簡單，其金屬結合區是其羧酸基團，主要有丁酸鈉、丙戊酸(valproic acid，VPA)、苯丁酸等。VPA是臨床治療癲癇發作的常用藥物，可通過調節控制基因表達的非編碼RNA發揮其作用。有學者研究了VPA處理對卵巢癌細胞H19表達的影響，以及H19水平與細胞凋亡和順鉑耐藥性的關系，結果顯示，VPA能下調H19表達，促進A2780細胞凋亡率的增加和提高A2780/CP細胞的順鉑敏感性[26]。在臨床前聯合用藥研究方面，多聚ADP核糖多聚酶(Poly ADP ribose polymerase，PARP)抑制劑——Niraparib可通過ATM-AMPK-ULK1途徑殺死卵巢細胞，導致mTOR失活和自噬小體的形成，還可激活CD95-FADD-caspase8通路，共同導致腫瘤細胞死亡[27]。而這些信號通路可被Beclin1、ATG5、CD95、FADD或AIF下調或c-flip-s、bcl-xl過表達及下調的caspase 9所抑制。VPA與Niraparib聯合作用于卵巢癌細胞時VPA能顯著增強Niraparib提高自噬小體水平的能力，還能增強胞漿ATM的激活。另外Niraparib可使CD95激活增加約50%，而聯合用藥可使CD95激活延長約400%。MRKVICOVA等[28]在研究丁酸鈉對順鉑敏感和順鉑耐藥卵巢癌細胞株A2780/A2780cis的抗癌作用時發現，順鉑處理組明顯抑制A2780、A2780cis細胞的增殖/活力，IC50分別為12.3、28.8 μmol/L，而丁酸鈉與順鉑聯合作用時細胞增殖/存活率顯著降低，IC50分別為0.7、11.8 μmol/L。在A2780、A2780cis細胞周期方面，丁酸鈉可抑制A2780細胞周期由G1期向S期轉變，使A2780cis細胞G1期細胞百分率增加和S期細胞百分率下降，順鉑可使A2780、A2780cis細胞阻滯于G2期。當順鉑聯合丁酸鈉作用時丁酸鈉能消除順鉑誘導的G2期阻滯，并能使A2780、A2780cis細胞大量聚集在S期。

2.3 環狀四肽類

環狀四肽類HDACI根據官能團分為兩類，一類含(S)2-氨基-9、10-環氧-8-氧代癸酸[(2S，9S)-2-amino-9，10-epoxy-8-oxodecanoic acid，Aoe]和環氧酮；另一類不含Aoe結構，主要有Apicidin、FK228、Trapoxin等。在卵巢癌中Apicidin、FK228的研究較多。Apicidin是從鐮刀菌中分離的一種環狀四肽，其癸酸側鏈、大環結構和色氨酸側鏈競爭性結合HDAC。AHN等[29]發現，Apicidin通過下調基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)表達抑制HDAC4與RECK啟動子Sp1結合元件的結合，抑制卵巢SKOV3細胞遷移。FK228具有環狀脫肽結構，但其主要作用機制是還原產生“彈頭”硫醇基團的特征二硫鍵,硫醇與HDAC蛋白催化中心的鋅結合,抑制酶活性。WILSON等[30]發現,FK228聯合順鉑作用時能增強順鉑對SKOV3細胞的毒性作用。當FK228與順鉑聯合作用時與對照組和單獨使用每種藥物比較，DNA損傷標志物——pH2AX的表達更高，免疫熒光檢測到的全核病灶和 pH2AX 飽和染色的病灶數量及水平也顯著上調。另外體內試驗表明，FK228、順鉑和聯合治療減少了小鼠的腫瘤體積，聯合治療小鼠的腫瘤生長速度最慢。隨后對提取的腫瘤進行IF染色，FK228與順鉑聯合將pH2AX彌漫性核染色從 8.53%提高至 26.19%。另有研究發現，ZEB1的表達被FK228抑制，而ZEB1的抑制增加了間充質卵巢透明細胞癌細胞中Bcl-2相關卵巢死亡基因的表達，進而克服ABT-263的抗凋亡作用[31]。

2.4 苯酰胺類

苯酰胺類HDACI的研究沒有前3種HDAC抑制劑廣泛，其主要包括MS-275(Entinostat)和 MGCD0103(Mocetinostat)。在卵巢癌中Entinostat的研究較多。有研究發現，在高級別漿液性卵巢癌細胞中，Panobinostat雖能顯著提高高級別漿液性卵巢癌細胞HEY、OVSAHO，但在增加順鉑敏感性方面不如Entinostat有效，Panobinostat治療HEY、OVSAHO的IC50分別為2.75、3.01 nmol，Entinostat治療HEY、OVSAHO的IC50分別為1.39、1.02 nmol[25]。GUPTA等[32]發現,Entinostat通過降低 BRCA1 表達和阻止復制叉進展抑制同源重組(Homologous recombination，HR)修復，增強olaparib誘導的不可修復的 DNA 損傷和最終的卵巢癌細胞死亡；Entinostat、olaparib聯合作用減少了SKOV3異種移植模型中的腹膜轉移，并延長了細胞周期調節蛋白E1(Cyclin E1，CCNE1)擴增HR敏感的異種移植瘤模型中的存活率。一項動物實驗發現，與對照組比較，Entinostat治療組異植瘤小鼠腫瘤重量和出現腹水概率均顯著降低，OS顯著延長(分別為74、62 d)，差異有統計學意義(P=0.005)。表明在免疫功能正常的小鼠中Entinostat治療能顯著減小卵巢腫瘤大小，延長生存期[33]。

3 小結與展望

卵巢癌的研究一直為婦科腫瘤領域的熱點之一，因其缺乏特定的早期篩查指標，導致其發現通常已是晚期。其標準治療是細胞減瘤術聯合術后化療，但化療產生的耐藥性，導致其復發率高、病死率高。HDAC的出現為卵巢癌的治療提供了一線希望。

近年來，已有許多研究驗證了卵巢癌的發生和發展與HDAC的過度表達有關，其通過可逆地調節組蛋白和非組蛋白的乙酰化狀態，在卵巢癌的發生和發展中起著關鍵作用。隨著研究的深入，發現敲除HDAC基因可誘導癌細胞周期停滯和凋亡，從而提供了一個關鍵的、有吸引力的抗癌靶點——HDACI。HDACI不僅能抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲及轉移，還能與順鉑、PARP抑制劑聯用，增強順鉑的敏感性和PARP抑制劑誘導的不可逆的DNA 損傷。目前，越來越多的研究表明，聯合治療可能是提高HDACI療效的另一個重要方向，深入研究HDAC與HDACI的作用機制，將會為HDACI在腫瘤中的應用提供光明的前景。