基于網絡藥理學研究桑白皮治療類風濕性關節炎的作用機制

楊佩璇，陳一村

（汕頭大學醫學院第一附屬醫院，廣東 汕頭 515041）

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種發病機制不明的多關節慢性炎癥性疾病.中醫藥治療RA在于改善癥狀體征及關節功能障礙，進而提高生活質量[1].目前中藥在治療RA上也有一定的療效.桑白皮為桑科桑屬植物的干燥根皮桑（拉丁學名：Morus alba L.），其藥理作用有鎮痛、消炎、鎮咳、平喘、降血糖、降脂、抗糖尿病周圍神經病變作用等[2].桑白皮總黃酮對小鼠醋酸所致的外周疼痛和急性炎癥期有明顯的抑制作用[3].韋寧等[4]收集古醫籍及現代醫家臨床經驗發現桑白皮配伍桑葉、桑枝、黃芩、麻黃、連翹、赤小豆等可治療類風濕關節炎[4].網絡藥理學在中藥活性成分、作用靶點及其機制研究中的應用方面有著獨特的優勢.本研究將采用網絡藥理學方法來預測桑白皮治療RA的靶點及可能的作用機制，為臨床治療提供理論依據.

1 資料與方法

1.1 數據庫與軟件

表1 實驗所用的數據庫與軟件

1.2 桑白皮活性成分及靶點篩選

在中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）中，以“sangbaipi”為關鍵詞，查找桑白皮的所有化學成分.桑白皮的主要活性成分以口服生物利用度（0B）≥30%、類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件收集出來，并在此數據庫中檢索出其主要活性成分對應的靶點蛋白，將靶點蛋白對應的基因簡稱用STRING或Unitprot數據庫查找獲得.

1.3 RA靶點的獲取

以“Rheumatoid Arthritis”為關鍵詞分別在人類基因數據庫GeneCards和DisGeNET數據庫中檢索，根據一定的條件篩選出類風濕性關節炎疾病的基因，整合并刪除重復值.

1.4 桑白皮治療RA的活性成分網絡分析

桑白皮與RA的共同靶點通過在線韋恩圖繪制平臺進行計算，并將藥物與疾病的共同靶點繪制成圖.用Cytoscape軟件構建出交集靶點與疾病、藥物的網絡關系，并通過分析相關的網絡參數來推測桑白皮發揮治療RA作用的可能成分.

1.5 蛋白相互作用網絡（PPI）的構建

將上述“1.4”項下兩者交集的靶點上傳到STRING數據庫，選擇“多種蛋白質”和物種“人”，其余不變.導出得到的蛋白相互作用圖的相關數據，并利用Cytoscape3.8.2進行蛋白相互作用網絡的可視化.

1.6 生物功能與通路富集分析

將得到的交集靶點導入DAVID6.8數據庫，對本研究獲取的桑白皮治療RA的關鍵靶蛋白進行GO（Gene Ontology，基因本體論）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）通路富集分析.以P＜0.01作為篩選條件，得到的分析結果用微生信在線繪圖平臺進行可視化.

1.7 潛在作用靶點與關鍵通路網絡構建

從“1.6”項獲得參與RA的20條KEGG通路后，與中藥、成分、共同靶點一一對應，并將其共同輸入到Cytoscape3.8.2軟件中，構建“藥物-活性成分-潛在靶點-關鍵通路”網絡關系.

2 結果

2.1 桑白皮活性成分的篩選

在中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）搜集桑白皮所有化學成分194個，根據“1.2”項下的篩選條件得到桑白皮的潛在活性成分有31個，見表2.

表2 桑白皮主要化學成分信息

2.2 桑白皮成分抗類風濕性關節炎的潛在作用靶點預測

在TCMSP中將桑白皮31個活性成分對應的靶點查找出來，并在Uniprot、STRING數據庫將其基因標準化，剔除重復和無效靶點后，得到有效靶點基因190個.在GeneCards、DisGeNET中檢索RA的作用靶點，整合后并剔除重復值，得到RA疾病的作用靶點647個.利用在線韋恩繪制平臺繪制韋恩圖并得到桑白皮治療RA的交集靶點有 38個，如圖 1，分別為 NOS2，PTGS1，AR，PPARG，PTGS2，PIK3C，ESR1，SCN5A，NFKBIA，HSPA5，MYC，GJA1，IL1B，CXCL8，IL2，COL1A1，PTEN，MPO， COL3A1， MAPK14， NR3C1， IKBKB， TNF， MMP1， ICAM1， VCAM1，MMP3， FOS， MMP9， MAPK1， IL6， TP53， CXCL2， CRP， CXCL10， SPP1，RUNX2，CD40LG.這些靶點可能是桑白皮發揮治療RA的主要基因靶點.

圖1 桑白皮有效成分靶點-疾病靶點韋恩圖

2.3 活性成分關鍵靶點的網絡構建與分析

桑白皮與RA作用靶點相關的藥物活性成分有21個，將活性成分、中藥與疾病共同的關鍵靶點用Cytoscape 3.8.2軟件進行網絡構建，如圖2.圖中，菱形代表桑白皮的有效成分，圓形代表作用靶點.網絡顯示，藥物活性成分連接值在前5的為quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）、Glabrone（光甘草酮）、Moracin D（桑辛素D）、Iristectorigenin（9CI）（鳶尾黃酮甲素（9CI））.上述成分可能是桑白皮治療RA的重要活性成分，在治療RA中具有重要意義.

圖2 桑白皮“活性成分-靶點”網絡關系圖

2.4 共有蛋白的PPI網絡構建

將桑白皮與RA交叉的38個靶基因上傳至STRING平臺，物種設定為“Human”根據高級篩選條件“high confidence（0.4）”進行PPI網絡構建，即最低要求交互分數為0.4，檢索得到PPI網絡的相關數據，并將數據導入Cytoscape 3.8.2軟件繪制出桑白皮-RA關聯的蛋白交互的網絡圖，如圖3.由圖3可得，此網絡共包括節點38個，邊411個.圖中節點的大小和顏色與靶點間連線有關，連線越多，節點越大，度值越大；節點的顏色從黃色到深藍色，相應的度值也逐漸變大.結果提示，桑白皮對抗RA的靶標中Degree值最高的靶點TNF、IL6、IL1B、PTGS2、TP53、MMP9、CXCL8、NFKBIA、PPARG、VCAM1，度值分別為36、35、34、33、33、32、30、28、27、26.這可能是桑白皮治療RA的關鍵靶點.

圖3 “藥物-疾病”交集基因的PPI網絡圖

2.5 GO功能分析與KEGG通路富集分析結果

在GO功能分析結果中，在P＜0.01基礎上選取生物過程（Biological Processes，BP）、分子功能（Molecular Functions，MF）、細胞組分（Cellular Components，CC）富集基因數目前10的生物學過程，利用微生信平臺進行數據可視化處理得到柱狀圖，如圖4，顯示桑白皮對RA的治療作用主要與細胞因子介導的信號通路、炎癥反應、細胞外區、細胞質、細胞外液、蛋白質結合、相同的蛋白質結合、酶結合等相關.

圖4 桑白皮治療RA的GO生物過程

對38個靶點進行KEGG通路富集分析，篩選P＜0.01，選擇富集前20的通路為候選通路，主要涉及到脂質和動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、癌癥通路、IL-17信號通路等信號通路.將上述信號通路利用微生信平臺進行數據處理后得到氣泡圖，如圖5.

圖5 桑白皮治療RA的KEGG通路

2.6 藥物-活性成分-潛在靶點-關鍵通路網絡構建結果

將關鍵信號通路與桑白皮治療RA的潛在作用靶點及藥物的活性成分進行一一映射，利用Cytoscape 3.8.2軟件構建藥物-活性成分-潛在靶點-關鍵通路關系網絡，如圖6，藍色圓形代表靶點基因，橙色菱形代表通路，黃色正方形代表藥物活性成分，紫色V字形代表藥物桑白皮.從網絡連接值的分析結果可知，桑白皮治療RA的機制可能是藥物中的 quercetin、kaempferol、Glabrone、Moracin D、Iristectorigenin（9CI）等有效成分通過MAPK14、TNF、IKBKB、IL6、MAPK1、NFKBIA、PTGS2、FOS、CXCL8、IL1B等關鍵靶點，作用于脂質和動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、癌癥通路、IL-17信號通路等通路，從而發揮治療作用.

圖6 藥物-活性成分-潛在靶點-關鍵通路關系網絡圖

3 討論

現代藥理學研究表明桑白皮的抗炎作用顯著，而RA的發病機制可能與免疫細胞、炎癥介質、基質金屬蛋白酶（MMP）、氧化應激異常、遺傳和生存環境因素等有關[5].網絡藥理學的問世為中藥作用于疾病的機制研究提供了一種新的方法和思路，它能夠從整體聯系到微觀，從多個層面系統地分析分子作用機制[6].

通過分析桑白皮有效成分顯示，桑白皮主要通過21個活性成分對RA進行干預治療，從網絡構建結果中可以得出度值排名靠前的有槲皮素、山奈酚、鳶尾黃酮甲素（9CI）、桑辛素D、光甘草酮等.這些成分也是桑白皮治療RA的關鍵成分.葉香蘭等研究認為槲皮素具有多種生物學活性，如抑制炎癥介質的表達和分泌、抗氧化、免疫調節、抑制滑膜細胞的增殖等，可以抑制RA的病理過程[7].另有研究發現槲皮素可通過抑制核因子（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化，減少炎癥條件下軟骨細胞中MMP-13的產生、基質降解和凋亡來保護軟骨[8].對于山奈酚，有研究者[9]通過體外和CIA小鼠的體內實驗研究，發現山奈酚降低了RA成纖維細胞樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLSs）的遷移、侵襲和MMP表達，還明顯的抑制了腫瘤壞死因子（TNF-α）誘導的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活，并且減輕了CIA小鼠關節炎的嚴重程度.Lin等[10]研究揭示了山奈酚可預防和治療RA、紅斑性狼瘡和強直性嵴柱炎等炎癥性疾病.鄒桂欣等研究發現鳶尾黃酮甲素對LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7建立的細胞炎癥反應中NO的生成量均有顯著抑制作用，進而表明其抗炎作用的相關關系[11].康艷賓等研究證實桑辛素對細胞的增殖、凋亡基因表達量有抑制作用[12].這說明桑白皮可能通過這些關鍵成分來發揮治療RA的作用.

從藥物-活性成分-潛在靶點-關鍵通路網絡結果得到，桑白皮的活性成分可能作用于MAPK14、TNF、IKBKB、IL6、MAPK1、NFKBIA、PTGS2、IL1B等網絡連接較多的靶點，而這些靶點可能是治療RA的關鍵靶點.如在免疫介導的RA的三個病理過程：炎癥、增殖和骨破壞中，MAPK起著重要的調節作用[13].有研究者通過實驗發現MAPK14抑制劑可幫助治療RA和其他慢性炎癥性疾病，同時具有靶向抑制MAPK14的化合物也應用到治療RA當中[14].尚華等[15]通過生物信息學分析RA作用機制可能包括調節多種細胞因子（如IL-6、TNF-α、IL-17等）分泌和免疫細胞（如Th17細胞、Th1細胞、Th2細胞、破骨細胞等）分化，調控自噬通路.而腫瘤壞死因子（TNF-α）是一種在RA發病機制中起重要調控作用的細胞因子.可見在桑白皮治療RA機制中，這些靶點可能起到關鍵作用.

在KEGG分析中顯示，桑白皮治療RA的作用機制主要通過脂質和動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路、癌癥通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等信號通路.如王志會等通過研究分析脂質代謝紊亂及內皮功能異常在RA患者早發動脈粥樣硬化中認為炎癥與脂代謝紊亂互為因果，氧化修飾型低密度脂蛋白可刺激血管內皮細胞表達單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白細胞介素1（IL-1）、TNF-α等致炎因子[16].TNF-α與TNF受體結合，能夠引起細胞內的信號傳導，調控目的基因的表達，造成炎癥反應和骨關節損傷[17].IL-17的致炎性很強，在RA的發病過程中有著重要作用，IL-17信號通路可激活多條通路如NF-κB、JNK等，呂芳[18]通過觀察Actl基因表達下降后IL-17誘導的IL-6和IL-8表達的變化，驗證了其參與了RA的發病.以上這些通路大多被證實對治療RA具有一定的調控作用.

綜上所述，本研究采用網絡藥理學方法對桑白皮治療RA的作用機制進行了預測，其發揮作用途徑涉及到多個成分、靶點及信號通路，但關鍵途徑的調控仍要深入研究，后續將通過體外細胞實驗和體內動物實驗等驗證.