小兒支氣管哮喘發作期中醫證型與PI3K/AktmiR-126通路的相關性分析*

王文亮 李 紅 徐甘霖 趙靈平

（廣東省深圳市兒童醫院，廣東 深圳 518026）

支氣管哮喘簡稱哮喘，是兒科常見病。據報道顯示，我國0～14歲兒童哮喘發生率為0.11%～0.23%［1］。哮喘在中醫屬“哮病”范疇，其在急性發作期如得不到有效控制，可演變為慢性哮喘，嚴重影響兒童身心健康［2］。準確辨證是中醫取得療效的前提條件之一。哮喘在發作期辨寒熱，緩解期辨肺、脾、腎之虛弱，因此哮喘證候分為：寒哮、熱哮、肺脾氣虛、肺腎兩虛［3］。對于哮喘的辨證論治，中醫學多從整體系統層面入手，而現代醫學多從客觀指標檢測入手，將兩者的優勢進行結合，將有助于臨床的診治［4］。據研究顯示，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路與支氣管哮喘進展息息相關［5］。此外，微小 RNA-126（miR-126）能通過促進PI3K/Akt信號通路參與類風濕關節炎的發生發展［6］。但未見小兒支氣管哮喘發作期中醫證型與PI3K/Akt-miR-126通路相關性的報道。基于此，本研究探討小兒支氣管哮喘發作期中醫證型與PI3K/AktmiR-126通路激活程度的關系。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1）西醫診斷標準［7］：反復發作喘息、氣急，伴或不伴胸悶或咳嗽，夜間和晨間多發，常與接觸變應原、冷空氣、物理、化學性刺激以及上呼吸道感染、運動等有關；發作時雙肺可聞及散在或彌漫性哮鳴音，呼氣相延長，上述癥狀和體征可經治療緩解或自行緩解；支氣管舒張試驗陽性（吸入支氣管舒張劑后，FEV1增加＞12%，且FEV1絕對值增加≥200 mL）；支氣管激發試驗陽性；呼吸流量峰值平均每日晝夜變異率＞10%，或呼吸流量峰值周變異率＞20%。符合上述癥狀和體征，同時具備氣流受限客觀檢查中的任一條，并除外其他疾病所引起的喘息、氣急、胸悶及咳嗽，可以診斷為哮喘。2）辨證分型標準：（1）寒哮型。主癥：喘息、咳嗽、氣短、喉中哮鳴有聲，胸膈滿悶、咯痰稀白有泡沫或呈黏沫狀。次癥：惡寒發熱、頭疼身痛、口不渴、渴喜熱飲；舌脈：舌質淡、苔白滑、脈浮緊或弦緊；滿足2個及以上主癥、舌脈，并有2個及以上次癥即可診斷。（2）熱哮型。主癥：喉中哮鳴如吼、氣粗息涌。次癥：咳嗽、痰黃黏稠、胸膈煩悶、面紅汗出、口渴，或伴發熱；舌脈：舌質紅、苔黃膩、脈滑數。滿足上述主癥，并且同時滿足至少3項次癥，結合舌脈即可診斷為熱哮型。3）納入標準：符合哮喘急性發作期西醫診斷標準［7］；符合《中醫兒科學》辨證分型標準，將哮喘組患兒分為寒哮型、熱哮型；年齡＜14周歲。4）排除標準：不符合納入標準者；并發其他嚴重疾患者；不配合研究者。

1.2 臨床資料

選取2020年1月至2021年12月深圳市兒童醫院收治的76例哮喘急性發作期兒童作為哮喘組。入組患兒按中醫證型分為寒哮型組40例，熱哮型組36例。選入同期30例體檢健康兒童作為對照組。所有兒童的監護人知情并簽署知情同意書，且本研究經本院倫理委員會審批通過。3組性別、年齡比較，差異無統計學意義（均P＞0.05）；且寒哮型組和熱哮型組病程比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組臨床資料比較

1.3 儀器與試劑

1）主要儀器：HDL-5臺式低速離心機（上海安亭，中國）、超凈工作臺（蘇州凈化，中國）、Mx3000P實時熒光定量PCR儀（Stratagene，美國）、Infinite酶標儀（TECAN，瑞士）。2）主要試劑耗材：八聯管（Axygen，美國）、無RNA酶吸頭（Axygen，美國）、96孔板（Axygen，美國）、IL-6 ELISA kit（聯科生物，杭州）、IL-1 ELISA kit（聯科生物，杭州）、基因引物合成（Invitrogen，美國）：miR-126-Upstream：5'-GGGGTCGTACCGTGAGT-3'；miR-126-Downstream：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6-Upstream：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；U6-Downstream：5'-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3'；PI3K-Upstream：5'-CGTGGGAGTACGTGAAACCT-3'；PI3K-Downstream：5'-CTGCTTTTGGGAGAGTCTGG-3'；Akt1-Upstream：5'-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3'；Akt1-Downstream：5'-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3'；β-actin-Upstream：5'-ATACCACCGCCAGGATGTTTAC-3'；β-actin-Downstream：5'-CCAACAGTTGGTCACAGAGGTC-3'。

1.4 研究方法

1.4.1 外周血樣本采集 按完全統一的方法收集研究對象外周血樣2次。其中1份用標準抗凝管取2 mL左右，并馬上分離外周血單核細胞，然后存放-80℃冰箱待用。另1份用標準生化管取5 mL左右，并馬上分離血清，然后存放-80℃冰箱待用。

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測 采用TRIzol提取外周血單核細胞總RNA，檢測合格后逆轉錄成cDNA。miR-126以U6為內參基因；PI3K、Akt1均以β-actin為內參基因。上機檢測后，按2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.4.3 ELISA檢測 采用促凝血管提取外周血，離心（2 000 r/min，10 min，4℃）后小心提取上層血清，按照白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1（IL-1）專用ELI-SA試劑盒說明書相關步驟進行操作。

1.4.4 哮喘控制評估 用哮喘控制測試（ACT）量表測評兒童哮喘病情［8］。該表共7個問題，患兒獨立完成前4個問題，每個問題分值范圍0～3分，監護人完成后3個問題，每個問題分值范圍0～5分。量表總分25分，得分越高的患兒，提示病情控制得越好。

1.5 統計學分析

應用SPSS23.0和Prism7.0軟件完成數據分析。計數資料用“%”描述，組間比較用χ2檢驗，多組間比較用R×C卡方檢驗。計量資料均符合正態分布，以（±s）描述，比較用獨立樣本t檢驗；多組間比較用方差分析F檢驗（兩兩比較用LSD-t檢驗）。用Pearson分析雙變量之間的相關性；進一步用多元線性回歸分析不同中醫證型患兒miR-126與ACT評分的關系，以不同中醫證型患兒miR-126為自變量，以ACT評分為因變量，并排除傳統因素（性別、年齡、病程）的影響。用二分類Logistic回歸分析PI3K/Akt-miR-126通路的激活與不同中醫證型患兒發病的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組miR-126、PI3K、Akt1、炎癥因子水平及ACT評分比較

見表2。各組miR-126、PI3K、Akt1、IL-6、IL-1表達從高至低依次為寒哮型＞熱哮型＞對照組（均P＜0.01）；且寒哮型的ACT評分低于熱哮型（P＜0.01）。

表2 各組miR-126、PI3K、Akt1、炎癥因子水平及ACT評分比較（±s）

表2 各組miR-126、PI3K、Akt1、炎癥因子水平及ACT評分比較（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.01；與熱哮型組比較，▲P＜0.01。下同。

組別熱哮型組寒哮型組對照組ACT（分）23.19±1.45 15.95±0.60-n 36 40 30 miR-126 2.06±0.86△3.50±1.26△▲1.00±0.00 PI3K 2.33±0.96△4.60±1.52△▲1.00±0.00 Akt1 3.22±0.99△5.10±1.65△▲1.00±0.00 IL-6（ng/mL）5.94±2.07△9.85±2.07△▲3.95±0.42 IL-1（ng/mL）12.06±1.17△16.65±2.03△▲8.66±0.63

2.2 不同中醫證型患兒miR-126與PI3K、Akt1、炎癥因子水平的相關性

見表3。經Pearson相關性分析顯示，不同中醫證型（熱哮型、寒哮型）哮喘患兒miR-126與PI3K、Akt1、IL-6、IL-1表達均呈正相關（均P＜0.01）。

表3 不同中醫證型miR-126與PI3K、Akt1、炎癥因子水平的相關性

2.3 不同中醫證型患兒miR-126與ACT評分的關系

見表4。經Pearson相關性分析顯示，熱哮型組miR-126與ACT評分呈負相關（r=-0.790，P＜0.01）；寒哮型組miR-126與ACT評分呈負相關（r=-0.871，P＜0.01）。排除傳統因素（性別、年齡、病程）的影響，多元線性回歸分析進一步顯示熱哮型或寒哮型組miR-126表達與ACT評分仍呈負相關（均P＜0.01）。

表4 多元線性回歸分析結果

2.4 PI3K/AKT-miR-126通路的激活與不同中醫證型患兒發病的相關性

見表5。因變量賦值：健康兒童＝0、熱哮型發病=1，以中位數為界值將miR-126、PI3K、Akt1轉換為二分類變量進行賦值：miR-126≤2.01=0、miR-126＞2.01=1，PI3K ≤ 2.08=0、PI3K＞2.08=1，Akt1≤ 3.00=0、Akt1＞3.00=1；健康兒童=0、寒哮型發病=1，以中位數為界值將miR-126、PI3K、Akt1轉換為二分類變量進行賦值：miR-126≤3.22=0、miR-126＞3.22=1，PI3K ≤5.01=0、PI3K＞5.01=1，Akt1≤5.27=0、Akt1＞5.27=1。結果顯示，外周血單核細胞中miR-126＞2.01、PI3K＞2.08、Akt1＞3.00為熱哮型組發病的危險因素（均P＜0.01）；miR-126＞3.22、PI3K＞5.01、Akt1＞5.27為寒哮型組發病的危險因素（均P＜0.01）。

表5 二分類Logistic回歸分析結果

3 討論

哮喘屬于中醫學“哮病”“咳嗽”“哮喘”等范疇，是一類易出現反復發作、痰鳴如吼、氣息喘促和呼吸困難的疾患。目前，中醫家對兒童哮喘急性發作期辨證論治分型仍無統一標準［9］，其中寒哮證和熱哮證是大家一致認可的證型。有學者提出，中醫現代化是中醫診斷標準現代化、客觀化［10］，由此探索應用生物學標志物來協助辨證論治是符合中醫基礎理論思想的。

本研究結果顯示，miR-126、PI3K、Akt1、IL-6、IL-1表達從高至低依次為寒哮型＞熱哮型＞對照組；且寒哮型的ACT評分低于熱哮型。寒哮證是哮喘重要的證型之一，該證型多因寒邪侵襲入肺，臟腑功能失調，津液輸布不利，肺氣宣降不利，發為喘息［11］。《金匱要略》中“病痰飲者，當以溫藥和之”，即是針對寒哮型哮喘急性發作期患者治療的重要理論［12］。此外，熱哮證是哮喘另一重要證型，該證型多因內有伏痰，遇感引觸，伏痰久瘀亦可化熱，則發為熱哮［13］。哮喘發病機制復雜，與氣道炎癥反應、氣道重塑、免疫失衡和變態反應等有關。IL-6是一類常見促炎因子，可與IL-1協同促T細胞增殖，誘發炎癥級聯反應，進而參與自身免疫反應。據研究表明，哮喘兒童炎癥反應得以減輕后，將有助于緩解呼吸道高反應性，進而改善氣道阻塞和支氣管痙攣癥狀［14］。現代醫學表明，AKT是PI3K的直接下游效應體，PI3K/Akt通路在氣道平滑肌細胞外基質沉積中發揮推進作用，進而參與哮喘的進展［15-16］。據研究證實，高山素可通過調節PI3K/Akt/NF-κB信號軸抑制炎癥反應，從而發揮抑制支氣管哮喘的作用［17］。血清miR-126水平被證實與兒童哮喘嚴重程度呈顯著正相關［18］。以上這些研究結論與本研究基本一致。

在血管內皮細胞中存在miR-126調控PI3K/ATK信號軸，從而影響血管新生、細胞遷移等功能。于是，本研究進一步分析了不同中醫證型患兒miR-126與PI3K、Akt1、炎癥因子的相關性，結果發現不同中醫證型（熱哮型、寒哮型）哮喘患兒miR-126與PI3K、Akt1、IL-6、IL-1表達均呈正相關，提示在哮喘患兒中可能同樣存在miR-126與PI3K/Akt信號軸相關調控作用，共同促進炎癥反應的過程。兒童肺、脾、腎三臟功能不足可致脾胃虛寒，寒哮型哮喘本為寒邪入侵所致，由此可能是寒哮證患兒外周血單核細胞中miR-126表達高于熱哮型的原因。可見通過對PI3K/Akt-miR-126通路中關鍵因子檢測，能作為小兒哮喘發作期中醫分型的輔助手段。本研究在排除傳統因素（性別、年齡、病程）的影響，多元線性回歸分析結果顯示熱哮型或寒哮型miR-126與ACT評分呈負相關，提示不同中醫證型小兒哮喘發作期外周血單核細胞miR-126表達越高，表明病情控制得越差。在小鼠哮喘模型中已發現IL-1、IL-4和IL-5等促炎因子，能通過參與氣道重塑，介導嗜酸性粒細胞和巨噬細胞的炎性浸潤［19］。據臨床前試驗研究提示，阻斷PI3K/Akt信號軸可以通過多種機制控制小鼠氣道重塑［20］。然而，目前鮮見PI3K/Akt-miR-126通路與哮喘患兒發病的相關性報道。本研究結果顯示，外周血單核細胞中miR-126＞2.01、PI3K＞2.08、Akt1＞3.00為熱哮型組發病的危險因素；miR-126＞3.22、PI3K＞5.01、Akt1＞5.27為寒哮型組發病的危險因素；提示PI3K/Akt-miR-126通路的過度激活參與了不同中醫證型兒童哮喘發作期的發生。

綜上所述，本研究發現不同中醫證型小兒哮喘發作期均與外周血單核細胞PI3K/Akt-miR-126通路的過度激活相關。PI3K/Akt-miR-126通路的關鍵因子表達在不同中醫證型哮喘患兒中存在顯著差異，可能具有作為哮喘患兒發作期中醫分型的客觀參考指標。然而，本研究仍存在一定的局限性，如樣本量偏少、缺乏不同中醫證型小兒哮喘緩解期和持續期的研究數據，還需進一步開展多中心、大樣本和更多證型的研究，以期為兒童哮喘的辨證論治提供更可靠的客觀研究數據。