參竹心康湯抗心衰大鼠心肌纖維化的實(shí)驗(yàn)研究*

成笑楠 喻正科 趙文博 李玉瑩

（1.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，湖南 株洲 412012；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

參竹心康湯是湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院喻正科教授的經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀之功效，治療心力衰竭療效確切［1］。嚴(yán)重心力衰竭患者1年生存率小于50%［2］。前期研究表明［3-5］，參竹心康湯能改善HF大鼠心肌重構(gòu)，具有明顯抗心肌纖維化作用，該方抗心肌纖維化作用與調(diào)控TGFβ1/CTGF通路有關(guān)［6］。本實(shí)驗(yàn)觀察參竹心康湯對(duì)微小核糖核酸-21（miRNA-21）/磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）以及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）的影響，探討參竹心康湯改善心力衰竭心肌纖維化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD雄性大鼠55只，SPF清潔級(jí)，體質(zhì)量（200±30）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理號(hào)為2020-0052。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

參竹心康湯（組成：黨參、麥冬、黃芪、三七、澤蘭、五味子、玉竹、丹參、黃精、葶藶子、姜黃），藥材購(gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科，煎藥機(jī)煎藥，濃縮至含生藥4.5 g/mL，冷卻后置于4℃冰箱備用。卡托普利片（華中藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H42020384，批號(hào)20190203，規(guī)格25 mg×100片），藥片研磨成粉，加入蒸餾水混勻，制成質(zhì)量濃度為3.25 mg/mL的混懸液，置于4℃冰箱備用。

1.3 試劑與儀器

Masson染色試劑盒（維爾生物科技有限公司，批號(hào)20201215）；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國(guó)北京康為世紀(jì)，CW2141）；CD31抗體，α-SMA抗體（英國(guó)Abcam，批號(hào)分別為ab28364、ab7817）；CoraLite488標(biāo)記的山羊兔抗IgG（H+L），CoraLite594標(biāo)記的山羊鼠抗IgG（H+L），PTEN抗體，GAPDH抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（美國(guó)Proteintech，批號(hào)分別為SA00013-2、SA00013-3、22034-1-AP、10494-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2）。光學(xué)顯微鏡（Motic，BA410T）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，H1650R）；熒光定量RCP儀，熒光PCR板（美國(guó)Thermo，型號(hào)分別為PIKOREAL96、SPL0960）。

1.4 模型制備

隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取45只大鼠復(fù)制CHF模型，采用腹主動(dòng)脈縮窄法［4］造模，剩余10只大鼠為假手術(shù)組。假手術(shù)組僅用無(wú)菌4號(hào)手術(shù)線穿過(guò)腹主動(dòng)脈下方，不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，其余操作步驟與造模組相同。造模后8周，從兩組中隨機(jī)各抽取3只大鼠，采用二維超聲引導(dǎo)M型曲線測(cè)量射血分?jǐn)?shù)（EF）、左室短軸縮短率（FS）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）。與假手術(shù)組比，造模組LVIDd有所增加（P＜0.05），LVIDs、LVESV均顯著增加（P＜0.01），EF、FS值均顯著下降（P＜0.01），提示CHF大鼠造模成功。見表1。

表1 兩組大鼠手術(shù)8周后超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較（±s）

表1 兩組大鼠手術(shù)8周后超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別假手術(shù)組造模組n 3 3 LVIDd（mm）5.73±0.83 7.03±0.45△LVIDs（mm）3.03±0.47 4.67±0.49△△EF（%）83.67±3.21 58.33±4.51△△FS（%）47.33±3.79 27.00±3.00△△LVESV（μL）73.33±30.55 253.33±72.34△△LVEDV（μL）463.33±174.74 610.00±193.13

1.5 分組與給藥

造模成功后大鼠隨機(jī)分為模型組、卡托普利組和參竹心康湯組，加上假手術(shù)組，共4組。假手術(shù)組和模型組蒸餾水灌胃10 mL/kg；卡托普利組卡托普利混懸液灌胃7.8 mg/kg；參竹心康湯組參竹心康湯濃縮液灌胃44 g/kg。各組均每天給藥1次，持續(xù)6周。課題組前期實(shí)驗(yàn)［5-6］表明參竹心康湯高劑量組改善心肌纖維化效果最優(yōu)，因此本實(shí)驗(yàn)參竹心康劑量設(shè)計(jì)為44 g/kg。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

給藥結(jié)束后將大鼠麻醉致死，取左心室分兩部分，一部分放于4%多聚甲醛溶液中固定，4℃保存。經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋后切片，用于心肌病理學(xué)檢測(cè)。另一部分迅速冷藏存放于-80℃液氮中用于RT-PCR及Western blotting試驗(yàn)。

1.6.1 Masson染色法觀察心肌病理變化 大鼠心肌石蠟切片常規(guī)脫蠟，按Masson試劑盒操作說(shuō)明染色、無(wú)水乙醇沖洗、吹干、透明、封片，使用光學(xué)顯微鏡觀察心肌纖維化程度。

1.6.2 RT-PCR法檢測(cè)心肌miRNA-21含量 取大鼠心肌組織0.25 mg，按照Trizol試劑說(shuō)明書提取心肌組織總RNA并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，以組織總mRNA為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄cDNA，50℃孵育50 min，85℃孵育5 min，以檢測(cè)的基因引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，取cDNA反應(yīng)液1 μL進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性10 min、95℃15 s、60℃30 s，經(jīng)歷40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，-ΔΔCt=對(duì)照組ΔCt-各樣品 ΔCt，2-ΔΔCt反映各樣品相對(duì)于對(duì)照組樣品目的基因表達(dá)水平的比值。在網(wǎng)址http：//www.mirbase.org/cgi-bin/query.pl?terms=214中搜索miRNA序列，運(yùn)用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工合成引物，引物序列見表2。

表2 引物序列

1.6.3 Western blotting檢測(cè)心肌PTEN的表達(dá) 取心肌組織0.025 g，完成蛋白提取后取5x蛋白上樣緩沖液50～200 μL蛋白上清中混勻，用沸水煮5 min后放入冰盒中冷卻備用，然后進(jìn)行電泳，制備凝膠并轉(zhuǎn)膜，配制5%的脫脂奶粉，封閉90 min，孵育一抗，PTEN（1∶2 000），GAPDH（1∶3 000），4℃孵育過(guò)夜，洗膜后孵育二抗，HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗（1∶5 000），HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶6 000），25℃孵育90 min，ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，掃描曝光后的底片，使用Quantity one專業(yè)灰度分析軟件對(duì)底片進(jìn)行分析。

1.6.4 免疫熒光雙染檢測(cè)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá) 將左室心肌石蠟切片脫蠟并水化，將切片浸入EDTA緩沖液（pH9.0），加熱后冷卻至室溫，用0.01 mol/L PBS（pH7.2～7.6）洗滌3次，再依次置入硼氫化鈉溶液、蘇丹黑染液中漂洗，使用10%正常血清/5%BSA封閉60 min，依次滴加孵育稀釋的一抗、二抗，DAPI工作液37℃染核，PBS沖洗3次，緩沖甘油封片后避光保存，使用熒光顯微鏡（400倍）觀察，應(yīng)用Image-Pro Plus5.1分析軟件，在相同的光學(xué)條件下測(cè)定表達(dá)CD31、α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度（IOD）值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理改變

見圖1。假手術(shù)組心肌細(xì)胞之間僅有極少量藍(lán)染的膠原纖維；與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織經(jīng)染色后見可大量藍(lán)染的心肌膠原纖維呈網(wǎng)格狀包繞正常心肌細(xì)胞，大面積纖維化組織代替正常心肌組織；與模型組相比，卡托普利組和參竹心康湯組心肌組織中膠原纖維顯著減少，但較假手術(shù)組膠原纖維量仍有所增多。

圖1 各組大鼠心肌組織病理改變（Masson染色，400倍）

2.2 各組大鼠心肌miRNA-21表達(dá)水平比較

見表3。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比，模型組、卡托普利組、參竹心康湯組大鼠miRNA-21表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比，卡托普利組、參竹心康湯組的miRNA-21表達(dá)顯著下降（P＜0.01），與卡托普利組比，參竹心康湯組miRNA-21表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。

表3 各組大鼠心肌miRNA-21及PTEN表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠心肌miRNA-21及PTEN表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與卡托普利組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別n miRNA-21PTEN假手術(shù)組模型組卡托普利組參竹心康湯組7 7 7 7 1.20±0.22 6.74±0.70△△4.20±0.63△△#1.98±0.47△#**0.29±0.04 0.07±0.02△△0.12±0.02△△#0.18±0.03△△#**

2.3 各組大鼠心肌PTEN蛋白表達(dá)比較

見表3，圖2。與假手術(shù)組相比，模型組、卡托普利組、參竹心康湯組的PTEN蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.01）；與模型組相比，卡托普利組、參竹心康湯組PTEN蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與卡托普利組比，參竹心康湯組PTEN蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠心肌PTEN蛋白電泳圖

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞CD31、α-SMA表達(dá)比較

見表4，圖3。綠色熒光為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，紅色熒光為間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核。結(jié)果顯示，假手術(shù)組中大量細(xì)胞表達(dá)CD31陽(yáng)性，而僅有極少量細(xì)胞表達(dá)α-SMA陽(yáng)性；模型組中則有大量細(xì)胞表達(dá)α-SMA陽(yáng)性，僅有少量細(xì)胞表達(dá)CD31陽(yáng)性，且模型組中CD31的表達(dá)較假手術(shù)組顯著減少（P＜0.01），α-SMA的表達(dá)較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.01）；參竹心康湯組與卡托普利組中大量細(xì)胞表達(dá)CD31陽(yáng)性，且CD31的表達(dá)較模型組顯著增加（P＜0.01）；僅有少量細(xì)胞表達(dá)α-SMA陽(yáng)性，且α-SMA表達(dá)較模型組減少（P＜0.05）。

表4 各組大鼠心肌組織中CD31、α-SMA的表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織中CD31、α-SMA的表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組卡托普利組參竹心康湯組n 7 7 7 7 CD31 2 808.00±183.13 769.00±341.94△△2 366.29±296.44△△##2 050.57±265.11△△##*α-SMA 1 271.71±163.79 5 260.86±1 925.15△△1 792.57±277.72△△#1 814.71±281.58△△#

圖3 各組大鼠心肌CD31、α-SMA表達(dá)（免疫熒光，400倍）

3 討 論

心肌纖維化是心衰發(fā)展過(guò)程中的重要病理變化，是由多種病理因素導(dǎo)致的心肌組織中成纖維細(xì)胞異常激活，進(jìn)而引起心臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞的異常增殖，細(xì)胞外基質(zhì)及膠原纖維過(guò)量沉積，心臟間質(zhì)重塑的一個(gè)過(guò)程［7］。EndMT是內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，在此過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞逐漸失去其特征性標(biāo)志物，如CD31等，獲得間質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)志物，如α-SMA等［8］。內(nèi)皮細(xì)胞在解剖學(xué)上類似于鱗狀上皮，有基底極性并呈緊密連接狀態(tài)。在胚胎發(fā)育期間，來(lái)自心內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化增加心臟瓣膜和心臟的隔膜、促進(jìn)脈管和淋巴管內(nèi)膜的形成［9］。而在病理狀態(tài)下，心肌組織中的內(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)膠原蛋白，這些物質(zhì)的病理性積累可破壞正常心肌結(jié)構(gòu)，造成心肌纖維化［10］。在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)中，有27%～33%的成纖維細(xì)胞來(lái)源于發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細(xì)胞［11］，這就促進(jìn)了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光檢測(cè)中，CHF大鼠大量心肌細(xì)胞表達(dá)α-SMA陽(yáng)性，僅有少量細(xì)胞表達(dá)CD31陽(yáng)性，表明HF大鼠心肌纖維化程度與End MT成正相關(guān)。由此可見，End MT是心肌纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵機(jī)制。

miRNA-21與心血管疾病的發(fā)展有著密切的關(guān)系［12］。miRNA-21在正常心肌中呈弱表達(dá)，但在心衰狀態(tài)下的心肌細(xì)胞中表達(dá)豐富，可以顯著抑制成纖維細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)心肌肥大和心肌纖維化。miRNA-21在心衰患者血清中濃度也會(huì)顯著升高［13］。miRNA-21的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)心肌纖維化的進(jìn)展［14］。本實(shí)驗(yàn)造模后，大鼠miRNA-21表達(dá)升高（P＜0.05），而干預(yù)后，卡托普利組、參竹心康湯組的miRNA-21表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。PTEN 定位于染色體10q23.31上［15］，PTEN具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶的雙重磷脂酶活性，可以通過(guò)脂質(zhì)磷酸酶的活性負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路［16］。磷脂酰肌3-激酶（PI3K）是一種進(jìn)化上保守的脂質(zhì)磷酸激酶，可以通過(guò)產(chǎn)生PIP3來(lái)激活絲氨酸蛋白激酶Akt，Akt活化的功能形式是p-Akt，具有促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分裂增殖等作用。本實(shí)驗(yàn)造模后，PTEN蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.01），而干預(yù)后卡托普利組、參竹心康湯組PTEN蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。miRNA-21可通過(guò)PTEN/Akt通路調(diào)控體內(nèi)外內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程［16-17］。敲除大鼠體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞中的miRNA-21基因，心肌纖維化中α-SMA間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目及Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白的表達(dá)顯著減少，心肌纖維化的進(jìn)程也得到延緩。miRNA-21通過(guò)PTEN通路在TGF-β1誘導(dǎo)EndMT中發(fā)揮作用［18］。

參竹心康湯由黨參、麥冬、黃芪、丹參、三七、澤蘭等藥物組成。方中黨參健脾益氣，令心氣生成有源，麥冬滋心陰養(yǎng)心血，二者共為君藥。黃芪助黨參培土生金，葶藶子使外滲之津得瀉，丹參、三七、姜黃、澤蘭活血化瘀，瘀血得化，新血得生，心體得養(yǎng)，共為臣藥。黃精上助黃芪補(bǔ)肺氣，中助黨參健脾益氣，下資腎臟益腎填精；五味子收澀外滲之津，玉竹養(yǎng)陰生津，佐助麥冬養(yǎng)心陰、生心血，同為佐藥。諸藥合用，心肺之氣充沛，陰血足而血脈充，瘀血化而血脈通，氣陰得補(bǔ)，瘀血得化，具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀之功效。前期研究表明參竹心康湯可以通過(guò)多種神經(jīng)、體液途徑改善心衰心肌纖維化。其中主要成分從不同途徑實(shí)現(xiàn)抗心肌纖維化功能，如黃芪中的黃芪多糖通過(guò)抑制TGF-β1/Smads通路從而達(dá)到抑制心肌纖維化的作用［19］；麥冬可通過(guò)抑制TGF-β1、p-Smad2/3和Smad2/3蛋白表達(dá)改善大鼠心肌纖維化［20］；丹參素通過(guò)抗心肌纖維化改善急性心肌梗死，與抑制TGF-β/CTGF通路相關(guān)［21］；三七皂苷通過(guò)降低心房顫動(dòng)大鼠血清和心房組織ICAM-1、TNF-α、MMP-2水平，升高TIMP-2水平抑制心肌纖維化［22］。本實(shí)驗(yàn)研究提示，CHF大鼠心肌發(fā)生了明顯的纖維化改變。CHF大鼠心肌組織中miRNA-21的表達(dá)上升（P＜0.05），PTEN表達(dá)下降（P＜0.01），表明纖維化的心肌組織中miRNA-21基因負(fù)性調(diào)控了PTEN的表達(dá)。經(jīng)參竹心康湯干預(yù)后，miRNA-21表達(dá)下降（P＜0.01），PTEN的表達(dá)上升（P＜0.01），大量細(xì)胞表達(dá)CD31陽(yáng)性，且CD31的表達(dá)較模型組顯著增加（P＜0.01），僅有少量細(xì)胞表達(dá)α-SMA陽(yáng)性，且α-SMA表達(dá)較模型組減少（P＜0.05），提示End MT逆轉(zhuǎn)。

總之，參竹心康湯可能通過(guò)抑制miRNA-21的表達(dá)調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路，從而抑制End MT，減輕心肌纖維化，治療心力衰竭。