補腎法中藥調控ERK/MAPK信號通路對Aβ25-35誘導的阿爾茨海默病大鼠模型的神經保護作用研究*

劉 爽 徐家淳 孫偉明 曹藝萌 王以申

（天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250）

隨著社會人口老齡化急劇發展，阿爾茨海默病（AD）發病率呈明顯上升趨勢［1-2］。AD是以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的原發性中樞神經系統退行性疾病。因此，AD患者極易發生跌倒等意外事故，繼而引發髖部骨折等一系列并發癥。同時，有認知缺陷的AD患者患腦血管疾病的風險明顯增加［3-4］。既往報告中指出大約2/3的AD患者為女性［5］。表明AD發病與中老年女性雌激素水平變化密切相關［6］。經研究發現，雌激素E2水平降低后會導致胞外信號調節激酶（ERK/MAPK）信號通路中各關鍵因子活化水平下降，進而激活一系列下游效應因子加重AD的病理變化［7］?；诖?，本研究以ERK/MAPK信號通路關鍵靶點p-ERK1/2為切入點，探討補腎法中藥治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級3月齡雌性SD大鼠36只，體質量200～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。所有大鼠在SPF級隔離飼養環境下飼養，給予充足的飼料和飲水，22℃，光照為12 h光照/黑暗循環。

1.2 藥物及試劑

1）補腎法中藥制備：組成為淫羊藿10 g，補骨脂5 g，制首烏5 g，女貞子10 g（購于天津中醫藥大學第二附屬醫院中藥房）。將上述藥物150 g（共5劑）混勻，加1 000 mL蒸餾水浸泡12 h，再加水1 000 mL，以80℃超聲30 min，過濾、提取，反復3次，混合濾液，以100℃水浴加熱，濃縮至500 mL，最終生藥質量濃度為0.3 g/mL。藥液常溫冷卻后，置4℃冰箱內保存備用。2）Aβ25-35的制備：無菌生理鹽水將Aβ25-35（Sigma公司）稀釋成4 μg/μL，37℃孵育96 h變為聚集狀態備用。

1.3 實驗儀器

Morris水迷宮實驗裝置（北京碩林苑科技有限公司），SDS-PAGE電泳儀和轉膜儀（BIO-RAD公司），凝膠成像系統（美國Bio Image system Gene公司），大鼠腦立體定位儀（BENCHmark公司）。

1.4 造模及分組

將36只雌性SD大鼠隨機分為假手術組12只、模型組12只、中藥組12只。模型組和中藥組采用單側側腦室注射Aβ25-35方法制作AD大鼠模型。10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，將鼠頭固定，備皮，碘伏消毒，頭頂部正中切口，暴露前囟，按大鼠腦立體定位圖譜進行側腦室定位：前囟點后方1.5 cm，旁開1.0 cm，深度為4.0 cm。緩慢注射5 mL聚集態的Aβ25-35溶液，注射持續5 min，留針5 min，使Aβ充分彌散，緩慢出針耗時5 min。骨科蠟封堵，雙氧水消毒，常規縫皮；假手術組向側腦室注入生理鹽水5 mL，操作與模型組一致。術后各組大鼠腹腔注射青霉素4萬U/只，連續3 d預防感染。實驗動物造模后1周，采用水迷宮實驗評估AD模型是否建立成功。

1.5 干預方法

參照《藥理實驗方法學》［8］中“人和動物間體表面積折算的等效劑量比值表”進行給藥劑量計算。中藥組于造模成功后予以中藥灌胃，按劑量10 mL/kg，每日1次，持續12周。假手術組及模型組于給藥組相同時間點，給予中藥相等劑量的蒸餾水灌胃，每日1次，持續12周。

1.6 觀察項目

1.6.1 大鼠認知記憶能力檢測 利用Morris水迷宮實驗對AD模型大鼠認知記憶力能力進行檢測。將水池分為4個象限，每個象限入水點的池壁上貼上不同的場景標記，平臺置于第2象限區域中央，略低于水面2 cm。實驗前將大鼠分別放入水迷宮中自由游泳2 min適應游泳環境。定位航行測試開始時，隨機選取4個象限入水點之一，將大鼠頭朝池壁放入水中，記錄大鼠入水至找到平臺時間為逃避潛伏期。若大鼠在2 min內未找到隱匿平臺，則由實驗者將其引向隱匿平臺，其潛伏期記錄為120 s，每次訓練間隔為60 s，歷時4 d，每天1次。攝像機位于水迷宮水池中央上方約200 cm，用于記錄動物的位置、游泳的軌跡距離和時間（用于計算出游泳速度）。

1.6.2 大鼠海馬神經元凋亡情況 取大鼠海馬CA1區組織切片，采用尼氏（Nissl）染色方法，切片脫臘，蒸餾水沖洗；加1%甲苯胺藍水溶液后置于54℃的溫箱內浸染25 min，蒸餾水沖洗，95%的乙醇分化30 s；用無水乙醇脫水，二甲苯透明，加蓋玻片，再用中性樹膠封片，境下觀察。

1.6.3 Western blotting檢測p-ERK1/2蛋白的表達 取各組大鼠海馬組織進行勻漿處理，按照核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒抽提總蛋白質，進行蛋白質定量。SDS-PAGE電泳分離，常規濕法轉膜，封閉處理。加一抗（p-ERK1/2，1∶1 000），搖床上低溫孵育過夜，TBS洗膜；加二抗（1∶5 000），搖床上常溫孵育2 h后，TBS洗膜。利用超敏ECL化學發光試劑盒，借助熒光成像儀觀察相關蛋白的表達，應用軟件對所得圖像結果測量灰密度值。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠死亡情況

實驗過程中共有3只動物死亡，其中假手術組2只，中藥組1只。

2.2 各組大鼠認知記憶能力比較

見表1。與假手術相比，模型組大鼠平均速度無顯著差異（P＞0.05），潛伏時間明顯延長，學習能力下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組大鼠平均速度無顯著差異（P＞0.05），潛伏時間明顯縮短，學習能力明顯上升，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行平均速度、學習能力比較（±s）

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行平均速度、學習能力比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

學習能力（s）組別假手術組模型組中藥組n 6 6 6平均速度（mm/s）185.02±25.78 189.01±32.55 182.20±45.63第1天29.70±1.97 40.38±4.12*37.61±6.48第2天13.58±2.23 28.30±6.17*15.73±1.70△第3天13.31±2.55 22.41±4.19*14.12±2.38△第4天10.98±1.10 18.83±2.60*10.95±0.93△

2.3 各組大鼠海馬神經元凋亡情況

見圖1。大鼠海馬CA1區尼氏染色結果顯示，與假手術組相比，模型組神經元凋亡數量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組神經元凋亡數量明顯減少（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠神經元凋亡數量比較（尼氏染色，200倍）

2.4 各組大鼠海馬組織p-ERK1/2蛋白表達比較

見表2，圖2。Western blotting結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠ERK/MAPK信號通路中關鍵靶點蛋白p-ERK1/2蛋白的表達明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，中藥組p-ERK1/2蛋白的表達增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）

圖2 各組大鼠海馬組織p-ERK1/2蛋白表達

表2 各組大鼠海馬組織p-ERK1/2蛋白表達比較（相對灰度值，±s）

表2 各組大鼠海馬組織p-ERK1/2蛋白表達比較（相對灰度值，±s）

組別假手術組模型組中藥組n 6 6 6 p-ERK1/β-actin 0.61±0.03 0.10±0.04*0.29±0.05△p-ERK2/β-actin 0.58±0.01 0.15±0.02*0.28±0.04△

3 討 論

隨著社會人口老齡化的發展，AD等老年退行性疾病的發病率呈明顯上升趨勢［1］，因其起病隱匿而被稱為“沉默的殺手”。而AD患者發病后由于神經功能的退變，可引發視覺障礙、記憶障礙、行為模式等發生變化，降低了AD患者生活自理能力，增加了跌倒等意外事件發生的風險［9-10］，極易引發骨折、出血等一系列并發癥。因患者長期運動功能受限，臥床時間長，深靜脈血栓形成，增加了肺部感染的概率。由Aβ引發的炎癥反應可導致腦血管系統受損，使AD患者更易伴發腦血管病變［3］，成為AD患者緊急就醫治療的主要原因，嚴重者可致殘甚至致死［11］，進一步威脅著AD患者的身心健康，增加了家庭生活和社會經濟負擔［12］。因此，有效防治AD發生與發展具有重要意義。

流行病學調查發現，絕經后婦女AD的發病率高出同年齡男性2～3倍［6］，而絕經后婦女最顯著的變化即為雌激素［主要為雌二醇（E2）］水平的明顯降低。已有研究證明AD女性患者血清中E2水平同樣明顯降低，其記憶水平的改變與E2含量改變呈正相關［13］。而且臨床上應用雌激素替代療法（ERT）也確有明顯降低AD發生與發展的作用，但因其副作用明顯，而限制了該療法的應用與推廣［14］。因此，治療AD更加安全有效的方法亟待發現。

研究顯示，E2通過非基因組效應激活細胞內的ERK/MAPK信號通路，是絲裂原MAPK信號通路中重要的一員，對細胞的生長、分化、分裂、死亡以及細胞間的功能同步化等起主要調節作用。激活的ERK/MAPK信號通路能進一步激活多種下游效應因子，如蛋白激酶、轉錄因子等，并調控基因的表達，共同作用于神經系統，進而發揮減緩AD相關病理變化及抑制細胞凋亡的保護作用［7］。經典ERK/MAPK信號通路通過三級酶促級聯反應激活，促使ERK磷酸化形成p-ERK，從而發揮神經保護作用［15］。

中醫經典“腎藏精”臟象理論認為，“腎生髓，腦為髓之?！??！夺t學入門》指出，“腦者髓之?！鑴t腎主之”。由此可見，腦與腎關系密切，腎精充盈，則髓海得養，神機運轉正常。AD發病與中醫五臟中腎的關系最為密切，脾、肝兩臟亦受累，腎虛證型最為多見，腎虛精虧、髓海不足是AD形成的基本病機［16］，并始終貫穿該病的全過程，補腎填精、充髓健腦是防止該病的根本大法［17］?；诖?，本研究中醫辨證論治以補腎法立法組方，選取淫羊藿、補骨脂、制首烏、女貞子4味補腎中藥作為基礎方。方中制首烏補肝腎，益精血，烏須發，強筋骨；女貞子滋補肝腎，明目；二者合用補肝腎，益精髓，腎陰得養則五臟安。淫羊藿補腎壯陽，祛風除濕，強筋骨；補骨脂補腎壯陽，溫脾補腎益精；兩者合用，溫補脾腎，興陽壯志，腎陽強則五臟得之溫煦。四藥合用取之“陰中求陽，陽中求陰”之意，相輔相成，共奏補腎填精、充髓健腦之功。

Morris水迷宮實驗結果顯示，中藥組大鼠潛伏時間延長，穿越平臺次數增加，提示補腎復方中藥能顯著提高AD模型大鼠學習及空間記憶能力，改善其空間記憶受損情況。同時，補腎復方中藥可抑制AD模型大鼠海馬神經元的凋亡，進而發揮神經保護的作用。補腎法中藥干預后，可明顯增加AD模型大鼠腦組織中ERK/MAPK信號通路中關鍵靶點蛋白p-ERK1/2蛋白的表達，說明補腎法中藥具有激活ERK/MAPK信號通路的作用。而活化的ERK/MAPK信號通路，可能通過調控下游一系列效應因子繼而發揮減緩AD相關病理變化及細胞凋亡發生的保護作用。

綜上所述，補腎法中藥對Aβ25-35誘導的AD模型大鼠海馬神經元損傷具有保護作用，可明顯改善AD模型大鼠認知和記憶能力，抑制海馬神經元凋亡，其神經保護作用機制可能與調控p-ERK1/2蛋白表達，激活ERK/MAPK信號通路有關。