金水六君煎含藥血清對香煙煙霧及脂多糖誘導BEAS-2B細胞COPD黏液高分泌的影響*

張 鈺 李福星 柳 卓 劉 雨△ 譚光波△

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫研究院，湖南 長沙 412000；3.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 412000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）簡稱慢阻肺，是一種常見的、可預防的疾病。據WHO預計，COPD將在2030年排名全球第3位死因［1］。慢性氣道黏液高分泌（CMH）是COPD的重要病理生理特征和臨床表現，近年來研究報道存在CMH的COPD患者在相同支氣管擴張等藥物維持下較其他類型患者急性加重更加頻繁，肺功能下降更嚴重，生活質量嚴重下降，病死率更高［2-3］。

金水六君煎出自《景岳全書》，臨床上治療慢性支氣管炎及COPD咳喘痰療效滿意，藥效學研究證明能明顯增加氣管液體分泌量，促進痰液排出［4］。COPD黏液高分泌除黏蛋白的絕對量增多外，還與黏蛋白/水鹽比例失衡有關［5-6］。前期研究表明，金水六君煎能通過下調黏蛋白MUC5AC抑制氣道黏液高分泌［7］，然而對MUC5AC蛋白表達的調控機制尚未進一步探究。前期文獻報道EFGR、VEGF蛋白可調控MUC5AC蛋白，從而改善COPD氣道黏液高分泌［8-9］。本研究通過觀察金水六君煎對體外人支氣管上皮細胞BEAS-2B細胞黏蛋白MUC5AC、EGFR、VEGF表達的影響，探討金水六君煎通過調控EGFR、VEGF蛋白治療COPD氣道黏液高分泌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

實驗細胞為BEAS-2B人支氣管上皮細胞，購自北納創聯生物科技有限公司，細胞培養在湖南中醫藥研究院細胞實驗室，培養箱條件為37℃，二氧化碳（CO2）濃度為5%。

1.2 實驗動物

24只雄性SPF級SD大鼠，體質量（250±50）g，湖南省湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SYXK（湘）2019-0004。飼養于溫度23～26℃，相對濕度40%～70%，通風換氣8～12次/h的環境。

1.3 實驗藥物

金水六君煎，藥物組成：熟地黃15 g，當歸6 g，半夏6 g，陳皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g，生姜5片。中藥飲片購自湖南省中醫藥研究院附屬醫院，加水煎煮制得生藥質量濃度為1.5 g/mL的藥液備用。

1.4 試劑及儀器

阿奇霉素（輝瑞制藥有限公司，國藥準字H10960112）；脂多糖（LPS）（碧云天，ST1470-10 mg）；常規化學試劑（上海國藥）；還原型5XSDS上樣緩沖液、1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）、10%APS、10%SDS、TEMED、PBST 緩沖液、30%Acr/Bic、電泳液緩沖液、轉膜緩沖液、10X麗春紅染液、脫脂奶粉（Abiowell，貨號AWB0004）；BSA（鹽城賽寶）；RIPA裂解液（Abiowell，貨號AWB0136）；蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達，貨號583794）；搖床；臺式冷凍離心機（湖南湘儀）；電泳儀（北京六一）；電泳槽（北京六一）；轉膜儀（北京六一）；旋渦混合器（江蘇其林貝爾）；磁力攪拌器（雷磁）；普通冰箱（奧克斯）；電磁爐（荷蘭飛利浦）；精密pH計（雷磁）；電子天平（美國雙杰）；生物樣品均質儀（杭州奧盛）；化學發光成像系統（勤翔）。

1.5 CSE和LPS的制備

1支香煙燃燒5 min的煙霧在注射器驅動吸引下溶于10 mL 37℃預熱的PBS溶液中，調節pH至7.4左右，經0.22 μm濾膜過濾除菌后作為100%CSE原液，用無血清培養液稀釋成不同濃度。CSE濃度（%）=CSE原液體積÷總體積×100%。LPS用PBS溶液進行溶解后，經0.22 μm濾膜過濾除菌后4℃備用。將脂多糖溶液按照20 ng/mL濃度配制，配制完成后攪拌搖動使液體均勻混合，過濾除菌并分裝密封放置在-20℃條件下保存備用。使用前根據所需濃度用高糖型DMEM基礎培養基稀釋。

1.6 含藥血清的制備

將SD大鼠隨機適應性飼養5 d后隨機分為空白組、金水六君煎低劑量組、金水六君煎中劑量組、金水六君煎高劑量組，各6只。金水六君煎方臨床用量60 kg成人每日服用50.5 g生藥，按臨床等效量為中劑量，0.5倍等效量為低劑量，4倍等效量為高劑量。按體表面積轉換為大鼠低、中、高劑量分別為2.63、5.26、21.04g/kg，即每日灌胃給藥分別為1.75、3.5、14.03mL/kg，每天1次，灌胃前空腹6 h，連續5 d。無藥血清組大鼠每日以3.5 mL/kg標準用生理鹽水灌胃。于第5日最后1次灌胃后1 h，以3%戊巴比妥鈉對SD大鼠腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，靜置2 h凝固后，以2 000 r/min離心10 min，用移液槍吸取上層清液即血清，合并同組血清，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，無菌試管分裝，置于-20℃冰箱內保存備用，避免反復凍融。

1.7 細胞培養

人支氣管上皮細胞（BEAS-2B）培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，37℃，5%CO2培養箱中培養，每1日換液1次，按1∶2比例傳代。

1.8 細胞分組及干預

取對數期細胞進行實驗，在T25培養瓶中加入DMEM培養基+10%FBS，37℃、5%CO2培養箱培養24 h至細胞貼壁。去原培養基，加入無血清DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱饑餓培養24 h。去原培養基，以培養瓶為單位，分為正常對照組（加入15%空白組大鼠血清）、模型組（加入15%空白組大鼠血清、10%CSE和20 ng/mL LPS）、金水六君煎組（加入10%、15%、20%金水六君煎含藥血清、10%CSE和20 ng/mL LPS）、阿奇霉素組（25 mg/L阿奇霉素、10%CSE和20 ng/mL LPS），37℃、5%CO2培養24 h后收集細胞進行檢測。

1.8.1 CCK-8法測定細胞活性 取對數生長期的BEAS-2B細胞稀釋吹打成濃度為5×103/mL的單細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔細胞懸液量為100 μL，設立空白對照孔（加培養基100 μL），實驗分正常組、模型組、金水六君煎組（10%、15%、20%）、阿奇霉素組，每組復孔數為6，各組細胞均在37℃，5%CO2環境下共同孵育24 h，按照試劑盒說明書，每孔加CCK-8溶液10 μL，溫育2.5 h后，酶標儀測定450 nm波長處各孔的吸光度（OD值）。計算細胞存活率=100-（正常細胞組吸光值-加藥組吸光值）÷（正常細胞組吸光值）×100%。顯微鏡下觀察各組的細胞數目和形態。

1.8.2 Western blotting檢測蛋白 將2～10代的人支氣管上皮細胞分為正常組、模型組、金水六君煎組和阿奇霉素組，培養細胞覆蓋T25培養瓶70%～80%時開始進行實驗。模型組、金水六君煎組和阿奇霉素組給予含有LPS 20 ng/mL、10%CSE的細胞培養液培養，正常組給予正常細胞培養液培養。干預12 h后，金水六君煎組給予15%含金水六君煎大鼠血清，阿奇霉素組予阿奇霉素25 mg/L。12 h后進行蛋白表達測定。分別將4組細胞置于RIPA裂解緩沖液中裂解，于12 000×g（4℃）離心15 min，收集上清，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，后電泳轉膜到NC膜上，封閉，孵育一抗和二抗。使用ECL化學發光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，凝膠成像系統成像。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 各組BEAS-2B細胞活性的比較

見圖1，表1。與正常組比較，模型組細胞活性顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，含藥血清組、阿奇霉素組細胞活性顯著上升（P＜0.05）。3組含藥血清組比較差異有統計學意義（P＜0.05），其中15%含藥血清組較10%、20%含藥血清組細胞活性顯著上升（P＜0.05）。顯微鏡下觀察各組細胞數目和形態：正常組貼壁后形態為梭形，細胞數目較多。模型組相較于正常組數目減少，形態大多數不規則。而3組含藥血清組和阿奇霉素組相較于模型組，細胞數目多，且形態基本規則，其中15%含藥血清組細胞數目最多，且形態較為規則。阿奇霉素組細胞數量雖較15%含藥血清組多，但形態較為不規則。

表1 各組細胞活性比較（±s）

表1 各組細胞活性比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，△P＜0.05；與15%含藥血清組比較，#P＜0.05。下同。

存活率（%）2.56±0.26 1.54±0.16△2.09±0.19*#2.69±0.22*1.80±0.21*#1.80±0.23*組別正常組模型組10%含藥血清組15%含藥血清組20%含藥血清組阿奇霉素組n 6 6 6 6 6 6

圖1 各組細胞形態學

2.2 各組BEAS-2B細胞MUC5AC蛋白表達的比較

見表2，圖2。與正常組相比，模型組的MUC5AC蛋白水平顯著升高（P＜0.05），提示模型造模成功。與模型組相比，金水六君煎組、阿奇霉素組可顯著下調MUC5AC蛋白水平（P＜0.05）。與阿奇霉素組相比，金水六君煎組MUC5A蛋白水平相當（P＞0.05）。

表2 各組BEAS-2B細胞黏蛋白MUC5AC表達比較（±s）

表2 各組BEAS-2B細胞黏蛋白MUC5AC表達比較（±s）

組 別n MUC5A蛋白量相對表達正常組模型組金水六君煎組阿奇霉素組6 6 6 6 0.18±0.10 0.44±0.01△0.31±0.07*0.30±0.01*

圖2 各組MUC5AC蛋白電泳條帶

2.3 各組BEAS-2B細胞EGFR、VEGF蛋白表達的比較

見表3，圖3。與正常組相比，模型組的EGFR、VEGF蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，金水六君煎組、阿奇霉素組可顯著下調EGFR、VEGF蛋白水平（P＜0.05）。與阿奇霉素組相比，金水六君煎組EGFR、VEGF蛋白水平相當（P＞0.05）。

圖3 各組EGFR、VEGF蛋白電泳條帶

表3 各組BEAS-2B細胞黏蛋白EGFR、VEGF表達比較（±s）

表3 各組BEAS-2B細胞黏蛋白EGFR、VEGF表達比較（±s）

組別正常組模型組金水六君煎組阿奇霉素組n 6 6 6 6 VEGFA（45 kDa）0.17±0.04 0.39±0.08△0.24±0.04*0.25±0.01*VEGFA（25 kDa）0.16±0.01 0.37±0.04△0.23±0.01*0.26±0.01*EGFR 0.15±0.02 0.39±0.04△0.28±0.05*0.25±0.04*

3 討論

近年研究認為氣道黏液高分泌是影響COPD病情進展和病死率的獨立危險因素［10］。近期有關文獻報道，COPD臨床表型為急性加重慢支氣管炎型患者受氣道黏液分泌增加影響更嚴重，使用常規藥物維持后不能緩解［11］。中醫學多將COPD歸屬為“肺脹”“喘證”范疇。“虛、痰、瘀”貫穿于COPD疾病始終。COPD氣道黏液高分泌的中醫藥治療以“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”理論為指導。金水六君煎出自《景岳全書》，主治肺腎虛寒，水泛為痰，或外受風寒，咳嗽嘔惡多痰，喘急等證，其中二陳湯理氣燥濕化痰，當歸、熟地黃滋肺腎陰血以治本［4，12-13］。藥效學研究發現半夏提取物β-谷甾醇及金水六君煎可促進氣管分泌，使痰液稀釋有利于痰液排出［14］。前期研究發現金水六君煎明顯提高COPD氣道黏液高分泌大鼠模型CAMP含量及Na-KATP酶活性，抑制氣道黏液高分泌［15］。

相關研究表明黏液糖蛋白是氣道黏液的主要成分，主要由MUC基因編碼，其中MUC5AC是氣道上皮最重要的分泌型黏蛋白，其分泌機制涉及多個信號通路［16-18］。研究表明EGFR是受體酪氨酸激酶EerbB家族成員［5，19］，能夠介導杯狀細胞增生以及當氣道受到IL-17、TNF-α炎性細胞刺激后，活化的EGFR將細胞外信號傳到下游信號分子，導致MUC合成、分泌增加。且有研究發現選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑可以抑制杯狀細胞增生，下調MUC5AC的表達［20］。VEGF為血管內皮生長因子，相關研究表明血管內皮生長因子可使MUC5AC上調［21］。

目前國內外同于構建體外COPD氣道黏液高分泌的細胞模型主要人支氣管上皮細胞BEAS-2B、癌細胞株NCI-H292、肺腺癌細胞株A549［22-23］。研究發現，構建COPD氣道黏液高分泌細模型，人支氣管上皮細胞BEAS-2B具有特異性［24］。香煙煙霧和脂多糖可誘導氣道黏液高分泌，同時可使MUC5AC表達增高［25-26］。因此本研究采用香煙煙霧和脂多糖誘導BEAS-2B細胞建立體外COPD氣道黏液高分泌模型。采用10%CSE和20 ng/mL誘導BEAS-2B細胞，同時用正常大鼠及含藥血清干預24 h，結果模型組細胞活性較正常組顯著降低，金水六君煎能夠提升細胞活性。提示香煙煙霧以及LPS構建的模型細胞活性受損，金水六君煎可減少細胞損害。模型組MUC5AC蛋白表達較正常組均顯著升高，提示香煙煙霧以及LPS誘導可成功建立COPD氣道黏液高分泌細胞模型。與模型組比較，金水六君煎組能顯著降低MUC5AC表達，提示金水六君煎在翻譯水平抑制黏蛋白MUC5AC。模型組EGFR、VEGF蛋白表達較正常組均顯著升高，與模型組比較，金水六君煎組能顯著降低EGFR、VEGF蛋白表達，提示金水六君煎在翻譯水平抑制EGFR、VEGF蛋白表達。本實驗結果與文獻報道一致，COPD氣道黏液高分泌會出現EGFR、VEGF蛋白的高表達，而金水六君煎能夠抑制EGFR、VEGF蛋白的表達［12-13］。

綜上所述，金水六君煎可通過抑制MUC5AC、EGFR、VEGF蛋白表達改善香煙煙霧及脂多糖誘導的細胞的COPD黏液高分泌。由此推測，金水六君煎對MUC5AC蛋白的調控以及EGFR、VEGF蛋白調控呈正相關，為臨床金水六君煎治療COPD氣道黏液高分泌提供了新的理論基礎和思路。但金水六君煎調控黏蛋白MUC5AC與EGFR、VEGF蛋白的作用機制還需要進一步深入研究。