醒腦靜注射液對急性酒精中毒大鼠氧化應激損傷的保護作用*

姚麗梅 張陽兒 陳丁生 趙 威 王 奇 李偉榮△

（1.廣東食品藥品職業學院，廣東 廣州 510520；2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405）

急性酒精中毒俗稱醉酒，是指一次攝入大量酒精（乙醇）后發生的機體機能異常狀態，對神經系統和肝臟傷害最嚴重。短時間內大量酒精進入機體會給患者帶來較大傷害，甚至可以直接或間接導致死亡。急性酒精中毒的發生非常普遍，必須引起高度重視［1］。乙醇進入體內后，大部分在肝臟中被乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）氧化，使肝臟處于氧化應激狀態，對肝臟造成嚴重損傷［2］。

中醫認為酒性濕熱、味苦、有毒，飲之過多可導致疾病發生。早在《黃帝內經》中就有“酒性苦熱”的記載，巢元方《諸病源候論》論及“酒性有毒，而復大熱，飲之過多，故毒熱氣滲溢經絡，浸溢臟腑，而生諸病也”，提出酒的毒性，并指出飲酒過度會導致機體諸病發生［3］。急性酒精中毒初期以解酒為主，臨床上使用最多的中藥是醒腦靜注射液，療效得到廣泛確認［4］。醒腦靜注射液由麝香、梔子、郁金和冰片4味藥組成，具有開竅醒神、鎮靜止痙、清熱解毒、解郁行氣的功效，對酒精導致的意識障礙有顯著的促醒作用。本課題組前期研究表明［5］，醒腦靜注射液能促進急性酒精中毒小鼠體內乙醇的代謝，縮短小鼠昏迷時間，但對肝臟是否有保護作用并不清楚。本研究將采用急性酒精中毒大鼠模型，探討醒腦靜注射液的促醒作用以及對大鼠肝臟氧化應激損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，雄性，體質量200～300 g，廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（粵）2018-0034。飼養溫度24～26℃，相對濕度40%～70%，自由飲食水。所有實驗均經廣州中醫藥大學動物倫理委員會批準。

1.2 試藥與儀器 醒腦靜注射液，無錫濟民可信禾藥業股份有限公司，規格：10 mL/支，國藥準字號Z41020664。ADH、ALDH、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒，均購于南京建成生物科技有限公司，批號分別是：20180612、20180615、20181008、20170809、20170809。Trizol（批號：184608），購于美國賽默飛世爾科技有限公司；BestarTMqPCR RT Kits（DBI-2220）、Sybr Green qPCR MIX（DBI2043），購于廣州粵穗生物科技有限公司。ADH、ALDH引物由廣州粵穗生物科技有限公司合成。超聲波破碎儀（美國Sonics公司）；KDC-220HR高速冷凍離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）；多功能酶標儀（美國鉑金埃爾默有限公司）；普通PCR儀（美國PE公司）；Step One PlusTMReal-Time PCR System（美國Applied Biosystems公司）；Nano UV-3000微量核酸蛋白檢測儀（美國Thermo scientific公司）；制冰機（日本Sanyo公司）；恒溫水浴鍋（正基儀器有限公司）。

1.3 分組與造模 將40只大鼠適應性喂養4 d后隨機分為5組：空白組、模型組和醒腦靜注射液低、中、高劑量組，每組8只。實驗前12 h禁食不禁水，空白組大鼠腹腔注射生理鹽水，模型組和給藥組腹腔注射52%乙醇溶液［6-8］，注射量均為10 mL/kg體質量。

1.4 給藥方法 待大鼠翻正反射消失后，空白組、模型組靜脈注射生理鹽水，參考文獻［9-10］及預實驗結果，醒腦靜注射液低、中、高劑量組分別注射醒腦靜注射液1.5、3.0、6.0 mL/kg，各組給藥體積均為6 mL/kg，醒腦靜低、中劑量組用生理鹽水補足相應體積。

1.5 標本采集與檢測 記錄大鼠翻正反射消失維持時間，給予乙醇5 h后處死并立即取肝臟。剪取約1 g肝臟組織，按質量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入PBS緩沖液用超聲細胞破碎儀破碎組織，制成10%肝臟勻漿液，靜置10 min后，4℃高速冷凍離心20 min（12 000 g/min），吸取上清液并分裝。分別測定肝臟ADH、ALDH、SOD活性和肝組織蛋白、MDA、GSH含量。肝組織mRNA經提取分離純化，逆轉錄成cDNA，再進行熒光定量反應。設計引物序列見表1。qRTPCR反應體系：cDNA模板1 μL，上游引物、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 8 μL，2×BestarTMq PCR Master Mix（SYBR Green）10 μL，總體積20 μL。放置于Step One PlusTM熒光定量PCR分析儀進行擴增反應。反應條件：95℃預變性反應2 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環40次。溶解曲線的反應條件：95℃反應1 min，55℃反應1 min，95℃反應15 s，循環1次。記錄各組樣品擴增反應的Ct值，通過內參均一化處理后，運用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

表1 擴增基因的引物序列信息

1.6 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件進行數據處理，多組間均值比較采用單因素方差分析，事后檢驗采用LSD。計量資料以（±s）表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠翻正反射消失維持時間比較 見表2。與模型組比較，醒腦靜注射液各劑量組均能縮短大鼠翻正反射消失維持時間，中、高劑量組差異具有統計學意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠翻正反射消失維持時間比較（h，±s）

表2 各組大鼠翻正反射消失維持時間比較（h，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別模型組醒腦靜注射液低劑量組醒腦靜注射液中劑量組醒腦靜注射液高劑量組n8 8 8 8翻正反射消失維持時間4.26±0.56 3.92±0.68 2.92±0.24**2.59±0.16**

2.2 各組大鼠肝組織ADH、ALDH、SOD活性比較 見表3。相比空白組，模型組肝組織中ADH和ALDH活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，醒腦靜注射液中、高劑量組肝組織中ADH、ALDH、SOD活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠肝組織ADH、ALDH、SOD活性比較（U/mg，±s）

表3 各組大鼠肝組織ADH、ALDH、SOD活性比較（U/mg，±s）

組別空白組模型組醒腦靜注射液低劑量組醒腦靜注射液中劑量組醒腦靜注射液高劑量組n 8 8 8 8 8 ADH 4.83±1.94**1.81±1.12 2.58±0.77 3.77±1.65*3.69±0.79**ALDH 1.39±0.20**0.55±0.12 0.54±0.53 1.29±0.33**1.30±0.19**SOD 154.92±20.34 155.95±11.75 164.91±10.76 172.70±20.63*173.92±18.92*

2.3 各組大鼠肝組織GSH、MDA含量比較 見表4。相比空白組，模型組肝組織MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，醒腦靜注射液中、高劑量組肝組織GSH含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），對MDA含量無顯著影響。

表4 各組大鼠肝組織GSH、MDA含量比較（μmol/g，±s）

表4 各組大鼠肝組織GSH、MDA含量比較（μmol/g，±s）

組別空白組模型組醒腦靜注射液低劑量組醒腦靜注射液中劑量組醒腦靜注射液高劑量組n 8 8 8 8 8 GSH 2.72±1.36 2.27±1.04 2.67±0.94 4.57±1.89**3.51±0.21*MDA 1.12±0.21**1.63±0.41 1.62±0.31 1.44±0.24 1.54±0.31

2.4 各組大鼠肝組織ADH、ALDH mRNA表達量比較 見表5。相比空白組，模型組肝組織中ADH、ALDH mRNA表達量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，醒腦靜注射液中、高劑量組ADH mRNA表達量顯著升高（P＜0.05），低、中、高劑量組ALDH mRNA表達量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 各組大鼠肝組織ADH、ALDH mRNA表達量比較（±s）

表5 各組大鼠肝組織ADH、ALDH mRNA表達量比較（±s）

組別空白組模型組醒腦靜注射液低劑量組醒腦靜注射液中劑量組醒腦靜注射液高劑量組n 8 8 8 8 8 ADH 0.95±0.36**0.42±0.18 0.38±0.21 0.70±0.14*0.76±0.13*ALDH 1.11±0.26**0.13±0.18 0.55±0.10*0.63±0.18**0.51±0.17*

3 討 論

急性酒精中毒以神經系統和肝臟損傷最為常見，機體攝入的乙醇大部分由肝臟代謝，由于其脂溶性較強，小部分可通過血腦屏障進入大腦，作用于腦神經細胞的代謝酶，使中樞神經細胞出現興奮性表現。當機體攝入的乙醇過量，超出正常肝臟代謝范圍，導致肝臟處于氧化應激狀態，造成肝臟氧化應激損傷。酒精性肝損傷嚴重威脅酗酒人群的健康，已成為世界范圍內亟待解決的重要公共衛生問題。中醫認為酒為濕熱之品，濕熱易困遏脾胃，阻礙氣機，脾運化功能失司，土壅則木郁，導致肝疏泄失常，氣機郁滯，引起納呆、腹脹、脅痛等癥狀。現代醫學研究一般認為酒精性肝損傷與氧化應激、炎癥、線粒體功能障礙、凋亡與乙醛毒性等密切相關，氧化應激損傷為首要原因［11］。

我國古代醫家對急性酒精中毒的治法論述頗多，如明代醫家周慎齋在《周慎齋遺書·卷八·傷酒》中談到“酒客初病，發不甚重，解酒足矣，續自病重者，以內傷法立方，少加醒酒藥味”，指出急性酒精中毒的中醫治療原則早期應以解酒為主，隨著病情發展，應按照內傷疾病擬定治法與處方，同時配合醒酒藥物。醒腦靜注射液出自清代著名醫家吳鞠通的《溫病條辨》，是由中藥經典復方安宮牛黃丸精簡而成的水溶性靜脈注射液，有效解決了傳統丸劑起效緩慢、昏迷患者給藥困難的問題。醒腦靜注射液起效迅速，在臨床上廣泛用于腦梗死、腦出血急性期、顱腦外傷、急性酒精中毒等病癥。方中麝香芳香開竅為君，梔子清熱瀉火、涼血解毒為臣，郁金活血行氣、清心解郁、涼血解毒為佐，協同君藥、臣藥開竅通絡，冰片引藥上行為使。諸藥合用，共奏開竅醒神、鎮靜止痙、清熱解毒、解郁行氣之功［12］。醒腦靜注射液中所含的芳香開竅藥麝香和冰片具有快速促醒作用。劉亞敏等［13］研究發現，麝香、冰片可降低腦缺血時的興奮性神經遞質天冬氨酸，升高抑制性神經遞質γ-氨基丁酸和甘氨酸，對抗興奮性氨基酸毒性，起到保護腦缺血神經元的作用，這可能是其芳香開竅機制之一。本課題組前期研究［14-15］表明，醒腦靜注射液對酒精性昏迷動物模型具有促醒作用，機制與調控腦內谷氨酸和γ-氨基丁酸及相關受體NR2A、NR2B及GABAA功能與表達有關。進一步研究［16］發現，醒腦靜注射液可增加急性酒精中毒大鼠外側下丘腦區覺醒肽-1受體表達、減少腺苷水平、下調腺苷-1受體表達及平衡核苷轉運蛋白1表達，達到促醒作用。

有研究［17-19］表明醒腦靜注射液對大鼠腦缺血再灌注所致氧化應激損傷具有保護作用。為進一步明確醒腦靜注射液使急性酒精中毒大鼠促醒的同時，對肝臟氧化應激損傷的保護作用及機制，筆者開展了本項研究工作。結果表明，與模型組比較，醒腦靜注射液可顯著縮短急性酒精中毒大鼠翻正反射消失維持時間，逆轉由酒精引起的ADH、ALDH活力下降；基因表達結果也顯示醒腦靜注射液也顯著提高肝組織ADH和ALDH的mRNA表達水平，與ADH、ALDH活力測定結果相一致。本研究中急性酒精中毒雖然對大鼠肝組織SOD活性和GSH含量無明顯影響，但可導致肝臟氧化應激損傷，使肝組織產生大量MDA。與模型組比較，醒腦靜注射液能顯著升高SOD和GSH的含量，但對已產生的MDA無明顯的消除作用，表明醒腦靜注射液可阻止急性酒精中毒所致肝臟氧化應激損傷，對肝臟有保護作用，可能與方中梔子清熱瀉火、涼血解毒，郁金疏肝活血、行氣解郁功效有關，其深層機制有待進一步研究。