羥基化多壁碳納米管電化學傳感器制備以及應用研究

李軍濤，王 艷，李向前，陳素霞

(石家莊市第八醫院，河北 石家莊 050000)

抑郁癥是現代較為常見的心理障礙疾病，患者長時間處于情緒低落、運動抑制的狀態，對身體健康造成極大的影響，嚴重者甚至危及生命。抗抑郁藥是幫助緩解抑制癥的有效方法，目前常見的抗抑郁藥有氟伏沙明、舍曲林、氟西汀、帕羅西汀。這些藥物能夠有效緩解抑郁癥患者的癥狀，但是對我們體內代謝酶CYP2D6有一定的抑制作用。研究抗抑郁藥的抑制性能對指導臨床用藥有至關重要的作用，廣大學者進行了很多研究。有學者提出用高效液相色譜法分析藥物成分的抑制作用，但色譜法存在操作復雜、檢測時間長，儀器設備昂貴的問題[1]；用熒光光譜法對藥物成分進行抑制分析，改善了色譜法檢測時間長、操作復雜的問題，但設備昂貴的問題還是沒有得到很好的解決[2]。而電化學酶傳感器具有操作簡單、儀器簡單，選擇性好等優點，在2020年對近 5 年生物傳感器在酶抑制劑類藥物檢測中的應用進展進行綜述，證實電化學傳感器能夠有效檢測酶抑制活性[3]；但是電化學傳感器的具體應用還存在問題。本文在文獻[3]的研究基礎上，針對傳統酶體外檢測光譜法、色譜法設備昂貴的問題，用硝酸和硫酸混合溶液對多壁碳納米管進行羧基化，然后以此為基體制備Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 傳感器，并探討不同抗抑郁藥物對CYP2D6 的抑制作用,從而為臨床抗抑郁藥的指導用藥提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

本試驗主要材料：硝酸(佛山市華希盛化工有限公司)、硫酸(山東辰達化工有限公司)、氫溴酸右美沙芬(北京匯智泰康醫藥技術有限公司)、舍曲林(輝瑞制藥有限公司)、帕羅西汀(浙江華海藥業股份有限公司)、氟西汀(武漢多普樂生物醫藥有限公司)、氟伏沙明(武漢欣欣佳麗生物科技有限公司)：均為AR；多壁碳納米管(湖北科沃德化工有限公司，>95%)；CYP2D6(上海恒遠生物科技有限公司，PMO)。

本試驗主要設備：ADS-1720Q超聲波清洗機 (佛山市安迪信超聲清洗設備有限公司)；DZF-6090真空干燥箱(上海儀天科學儀器有限公司)；LIDA-20傅里葉變換紅外光譜儀(天津恒創立達科技發展有限公司)；SS-150冷場掃描電子顯微鏡(深圳市善時儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1c-MWCNTs的制備

(1)將H2SO4與HNO3按照體積比3∶1混合，取10 mL混合溶液，將10 mg多壁碳納米管分散于混合溶液中；

(2)將混合溶液置于ADS-1720Q型超聲波清洗機中進行超聲分散，超聲時間為30 min。取出混合溶液后，在室溫條件下充分攪拌，攪拌時間為4 h；

(3)對混合溶液進行抽濾，并用去離子水沖洗抽濾產物4次。然后將產物置于DZF-6090型真空干燥箱內充分干燥，干燥溫度和時間分別為60 ℃和12 h，得到羧基化多壁碳納米管；

(4)在4 mL去離子水中融入4 mg羧基化多壁碳納米管；然后置于ADS-1720Q型超聲波清洗機中超聲分散，超聲時間為30 min。

1.2.2Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 傳感器的組裝

(1)依次在1.0、0.3和0.05 μm的α-氧化鋁粉中對玻碳電極進行打磨；然后依次在體積比為1∶1的硝酸溶液、乙醇額溶液和去離子水中進行超聲清洗，清洗時間為3 min。撈出后置于室溫通風環境中干燥；

(2)將玻碳電極置于濃度為1 mol/L的H2SO4溶液中，然后采用CV法對玻碳電極進行活化[4]；CV法參數如表1所示 ；

表1 CV法參數Tab.1 CV method parameters

(3)活化后在玻碳電極上滴涂5 μL羧基化多壁碳納米管溶液，然后置于室溫通風環境中干燥。將干燥后電極置于100 mmol/L的EDC/NHS 溶液中浸泡1 h，之后在電極上滴涂5 μL的CYP2D6 酶溶液，繼續干燥，干燥溫度和時間分別為4 ℃和12 h；

(4)用pH值為7.4的濃度為0.1 mol/L的PBS沖洗掉玻碳電極中未固化的酶；然后在電極上滴加5 μL質量分數為0.5%的Nafion 溶液，繼續置于溫度為4 ℃環境下干燥保存[5]。

1.2.3Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 傳感器的電化學測量條件

本試驗采用三電極體系，其中參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑絲電極。傳感器直接電化學行為由CV法測得，循環伏安掃描電位和掃描速度分別為-0.8～0.1 V、50 mV/s[6]。對抗抑郁藥的測定則是采用DPV法，以含有20 μmol/L、pH值為7.4的右美沙芬作為測試底液，測試溫度為20 ℃。

抗抑郁藥抑制率(Inhibition)表達式[7]：

擬制率=(ip0-ipt)/ip0×100%

(1)

式中：ip0為抗抑郁藥抑制前的電流信號；ipt為抗抑郁藥抑制后的電流信號。

1.3 性能表征

1.3.1紅外光譜分析

用LIDA-20型傅里葉變換紅外光譜儀對c-MWCNTs進行掃描。

1.3.2掃描電鏡分析

用導電膠將c-MWCNTs固定在樣品臺上，然后放入SS-150型冷場掃描電子顯微鏡中進行掃描。

2 結果與討論

2.1 c-MWCNTs表征

2.1.1c-MWCNTs 的紅外表征

圖1為c-MWCNTs 的紅外譜圖。

圖1 c-MWCNTs的紅外譜圖Fig.1 Infrared spectrum of c-MWCNTs

2.1.2掃描電鏡表征

圖2為c-MWCNTs的掃描電鏡圖，其中圖2(a)為整體形貌；圖2(b)為局部放大圖。由圖2可知， c-MWCNTs較長，管徑分布較為均勻，且外壁光滑。

圖2 c-MWCNTs的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of c-MWCNTs

2.2 Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 電化學行為

2.2.1電化學交流阻抗

圖3為玻碳電極交流阻抗譜圖；測試底液為0.1 mol/L的KCl和5 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-混合溶液。

a-玻碳電極；b-c-MWCNTs/玻碳電極；c-CYP2D6/c-MWCNTs/玻碳電極圖3 交流阻抗譜圖Fig.3 AC impedance spectrum

由圖3可知，未經修飾的玻碳電極電子轉移阻抗大概為590 Ω。在玻碳電極修飾了羧基化多壁碳納米管后，其電子轉移阻抗下降比較明顯，這證明了羧基化多壁碳納米管具有良好的導電性，對電極表面的電子轉移有較好的促進作用[9]。將CYP2D6固定在修飾電極后，電子轉移的阻抗出現小幅度增加；這是因為CYP2D6為電的不良導體，玻碳電極固定了CYP2D6后，離子難以從溶液擴散至電極表面，使得阻抗變大。

2.2.2電極修飾過程直接化學

圖4為循環伏安曲線；測試底液是濃度為0.1 mol/L、pH值為7.4的PBS溶液;掃描速度為50 mV/s。

a-玻碳電極；b-c-MWCNTs/玻碳電極；c-CYP2D6/c-MWCNTs/玻碳電極

由圖4可知，未經CYP2D6修飾的玻碳電極和多壁碳納米管修飾電極上都沒有電流峰存在；而經過CYP2D6修飾后，循環伏安曲線有一對比較明顯的氧化還原峰出現[10-13]。這證明經過CYP2D6的修飾，玻碳電極上發生一定的電子轉移，進而表明在玻碳電極上成功固定了CYP2D6。

2.3 Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 在探針底物中的電催化

圖5為Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE傳感器在不同濃度的右美沙芬中，用DPV法測定的還原峰電流。

圖5 Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE傳感器在不同濃度右美沙芬中的還原峰電流Fig.5 Reduction peak current ofNafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE sensorin different concentrations of dextromethorphan

由圖5可知，隨右美沙芬濃度的增加，還原峰電流也持續增加；這證明本文制備的傳感器具備了CYP2D6對抑郁藥的代謝能力。

2.4 傳感器優化

圖6為DPV法測定Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE傳感器在含有10 μmol/L帕羅西汀，pH值為7.4、濃度為0.1 mol/L的PBS溶液中的抑制前后酶的生物活性，其中圖6(a)為還原峰電流信號隨時間變化圖；圖6(b)為抑制率隨時間變化圖。

圖6 抑制前后酶的生物活性Fig.6 Biological activity of enzyme before and after inhibition

由圖6可知，抑制前期，酶抑制率快速增加。當抑制時間達到36 min時，酶抑制率高達70.3%；當繼續增加抑制時間，抑制率增加趨勢變緩，因此，本試驗選擇的抑制時間為36 min。

2.5 抗抑郁藥對CYP2D2酶活性的抑制

表2為幾種抗抑郁藥的抑制效果。其中IC50是抑制率為50%時抗抑郁藥的濃度，IC50值大小表示該抑郁藥對CYP2D6的抑制能力。IC50值越小，則抗抑郁藥對CYP2D6抑制能力越強；當IC50比1 μmol/L小時，則該抑制劑為強抑制劑；當IC50位于1～10 μmol/L時，則該抑制劑為中抑制劑；當IC50位于10～50 μmol/L時，則該抑制劑為弱抑制劑；當IC50大于50 μmol/L時，該抑制劑為較弱抑制劑，此時可認定該抑制劑對CYP2D6沒有抑制[14-17]。

表2 幾種抗抑郁藥的抑制效果Tab.2 Inhibitory effect of several antidepressants μmol/L

由表2可知，幾種抗抑郁藥對CYP2D6的抑制能力從小到大依次為：氟伏沙明(IC50 22.8 μmol/L)、舍曲林(IC50 10 μmol/L)、氟西汀(IC50 3.9 μmol/L)、帕羅西汀(IC50 1.8 μmol/L)，這證明了舍曲林和氟伏沙明為弱抑制劑；帕羅西汀和氟西汀為中抑制劑。

2.6 傳感器的穩定性和重現性

測定Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE傳感器在含有20 μmol/L右美沙芬，濃度為0.1 mol/L、pH值為7.4的PBS溶液中的還原峰電流值。10次試驗結果標準偏差為4.3%，這證明了本文制備的傳感器具有比較好的重現性。將制備好的電極置于溫度4 ℃條件下進行保存，7 d后觀察信號損失為4.5%；這證明該傳感器具有較好的穩定性。

3 電化學傳感器的應用

基于以上傳感器對不同抗抑郁治療藥物抑制作用的分析，以對CYP2D6抑制最強的帕羅西汀藥物為例，結合于2020年1月～2021年4月收治的抑郁患者102例作為研究對象，將102例患者分為觀察組和對照組，其中對照組給予帕羅西汀，每早1次；觀察組給予帕羅西汀+失眠認知行為指導。由此對比患者在治療前及治療1、3和6個月的PSQ-T評分[18-20]；具體結果如圖7所示。

圖7 治療前后的PSQ-T評分對比Fig.7 Comparison of the PSQ-T scores beforeand after treatment

由圖7可知，與治療前比較，2組患者治療1、3和6個月后PSQ-T評分顯著降低(P<0.05)；治療1個月聯用PSQ-T評分顯著低于單用組(P<0.05)。在采用帕羅西汀+失眠認知行為指導的觀察組的PSQ-T得分低于對照組，說明采用這種治療方式可有效治療抑郁并有失眠的患者。

4 結語

本試驗以體積比為3∶1的H2SO4與HNO3混合溶液制備的以c-MWCNTs為基底制備Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 傳感器。通過對 c-MWCNTs微結構和Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 傳感器電化學行為進行表征，得到的具體結論為：

(1)經過體積比為3∶1的H2SO4與HNO3混合溶液作用，成功在多壁碳納米管上引入羧基。且制備的c-MWCNTs管徑均勻，外壁較光滑；

(2)玻碳電極表面成功固定CYP2D6后，離子難以從溶液擴散至電極表面，傳感器阻抗變大；

(3)DPV法測定的還原峰電流證明Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE傳感器具備CYP2D6對抑郁藥的代謝能力；

(4)DPV法對抑制前后酶的生物活性進行測定，在抑制時間為36 min時，酶抑制率為70.3%。而后隨時間增加，酶抑制增長速度變慢，確定抑制時間為36 min；

(5)幾種抗抑郁藥中，舍曲林和氟伏沙明為弱抑制劑，帕羅西汀和氟西汀為中抑制劑。對CYP2D6的抑制能力大小依次為：氟伏沙明(IC50 22.8 μmol/L)、舍曲林(IC50 10 μmol/L)、氟西汀(IC50 3.9 μmol/L)、帕羅西汀(IC50 1.8 μmol/L)；

(6)傳感器在4 ℃環境下保存7 d，信號損失僅為4.5%；10次還原峰電流值標準偏差僅為4.3%，證明本試驗制備的傳感器具有較好的重現性和穩定性。