SLC44A5對肺腺癌細胞遷移影響

王 思， 曲 玥 陽， 肖 桂 山

( 大連理工大學 化工學院, 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

腫瘤的發病率和死亡率逐年升高．2020年全球癌癥數據統計顯示，全球大約有肺癌新發病例220萬，發病率為11.6%；死亡病例180萬，遠超其他癌癥類型，以18%的死亡率位居所有惡性腫瘤之首[1]．肺癌早期癥狀較為隱蔽，臨床上多數患者出現癥狀就診時就已屬晚期．隨著病程的進展，10%～15%的患者會出現骨轉移[2]，25.4%～65.0%的患者可發生腦轉移，生存時間超過2年的肺癌患者腦轉移發生率高達80%[3]，致使晚期肺癌5年整體生存率較低．因此，研究肺癌轉移分子機制，探索新的治療藥物具有重要意義．

SLC44A5是膽堿轉運蛋白，膽堿是乙酰膽堿和磷酸膽堿的前體[4]，也是形成膜磷脂磷脂酰膽堿所必需的[5]，膽堿還可以支持細胞膜的合成，從而促進細胞增殖[6]．SLC44A5可通過降低細胞內膽堿水平誘導細胞凋亡來抑制細胞生長[7]，從這個意義上說，癌癥中膽堿轉運體的鑒定和表征可能為抗腫瘤策略的設計提供新的靶點．因此，在癌細胞中識別膽堿轉運蛋白是非常重要的．膽堿轉運系統分為3類轉運蛋白：高親和力膽堿轉運蛋白(CHT1/SLC5A7)，中等親和力膽堿轉運蛋白樣蛋白(CTL/SLC44A1-5)和低親和力的多特異性有機陽離子轉運蛋白(OCTs/SLC22A1-2)[8]．已有文獻報道CTL/SLC44A1-5廣泛存在于不同人體組織中[9]．大鼠和人類中樞神經系統中SLC44A1的存在表明，這種轉運蛋白的功能失調可能對損傷后的神經系統發育和修復以及神經退行性疾病具有重要意義[10]．SLC44A2在心臟、結腸、肺、腎和肝臟中表達為兩種亞型，即SLC44A2-P1和SLC44A2-P2，這表明組織特異性差異可能會影響其在每個組織中的功能[11]．SLC44A3在腎臟、回腸和結腸中中度表達，SLC44A4在胃和腎臟中高表達．關于SLC44A5表達的研究可用數據少得多，其在脊髓中的表達明顯高于SLC44A1[12]．雖然CTL/SLC44A1-5的分布已有相關文獻報道，然而，對SLC44A3-5功能的相關研究較少．在已有報道中，Sugimoto等發現SLC44A5在進入腎臟途徑前轉運膽堿而不轉運磷酸膽堿，說明SLC44A5有助于維持細胞膽堿水平[13]．Peng等發現SLC44A5在肝癌中促進癌細胞凋亡抑制侵襲[14]，然而其在肺腺癌發生發展過程中的功能尚待研究．因此本研究將初步探討下調SLC44A5對肺腺癌細胞系增殖能力和遷移能力的影響．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺腺癌細胞系H1299和H1792均購自美國ATCC公司．MTT(M8181-1g)試劑、青鏈霉素混合液(100×)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(PC0020)、Tween 20均購自北京索萊寶生物科技有限公司．胎牛血清、1640培養基、Trypsin-EDTA胰酶購自Gibco公司．ECL超敏發光液(P1010)、RIPA裂解液購自北京普利萊公司．蛋白免疫印跡實驗相關化學試劑購自天津大茂化學試劑廠．質粒小提中量試劑盒(DP106)、TRNzol Universal總RNA提取試劑(DP424)購自天根生化科技(北京)有限公司．SLC44A5(APREST83577)抗體購自Sigma公司．鼠二抗(A25012)和羊二抗(A25022)購自Macklin公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 細胞系H1299、H1792、H1299對照組及H1792對照組使用含10% FBS和1%雙抗的1640培養基，H1299 shSLC44A5和H1792 shSLC44A5使用含10% FBS、1%雙抗和2 μmol/L DOX的1640培養基，置于37 ℃、5% CO2的培養箱(Thermo Fisher Scientific)中培養．

1.2.2 RT-qPCR分析 采用TRNzol Universal從H1299細胞中提取總RNA，用酶標儀測定其濃度與質量，按照PrimeScriptRRT Reagent Kit試劑盒說明將其反轉錄成cDNA，再經過擴增后，上機檢測．GAPDH前引物：5′-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3′，后引物：5′-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3′；SLC44A5前引物：5′-TCAAGTTTGCAGTGATTCAGGC-3′，后引物：5′-TCCTTGGATCACCAAAGTCCTC-3′．

1.2.3 轉 染 在6孔板中接種細胞，待細胞融合度在60%～80%時將細胞培養基換成無血清培養基．將SiRNA干粉于12 000 r/min下離心2 min，使用depc水溶解，制備成最終濃度為20 μmol/L 的儲備液．按細胞種類，每孔按5～8 pmol 的用量，使用150 μL無血清培養基稀釋SiRNA儲備液；每孔按5～8 μL LipofectamineTM2000用量，使用150 μL無血清培養基稀釋轉染試劑．室溫孵育5 min．將稀釋好的SiRNA工作液和轉染試劑按1∶1混合．室溫孵育20 min．將混合液加入6孔板中．6 h后換成完全培養基．48 h 后提取RNA用于后續測定．

1.2.4 低表達細胞模型建立 設計SLC44A5 SiRNA，將篩選后的SLC44A5 SiRNA序列轉換成shRNA序列，整合到pLKO-Tet-On載體上，將構建好的shSLC44A5質粒和pLKO-Tet-On質粒包裝成慢病毒，感染野生型H1299和H1792細胞，使用G418篩選至少3代得到SLC44A5低表達細胞系．

1.2.5 Western Blot檢測 用胰蛋白酶消化待提取的目標細胞，按說明書比例加入RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶抑制劑，置于冰上孵育10 min，12 000g離心15 min，上清液即為所提取細胞蛋白．使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，按比例加入4×上樣緩沖液后置于70 ℃金屬浴中煮10 min，然后保存于-20 ℃冰箱．每條泳道加入20 μg蛋白樣品，設置恒壓80 V跑完濃縮膠后恒壓調至130 V跑分離膠，隨后切取凝膠上目標蛋白條帶轉移至甲醇活化過的PVDF膜上，300 mA約70 min恒流轉膜，用快速封閉液封閉0.5 h，用TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min，加入一抗(體積1∶1 000稀釋)置于冰箱4 ℃孵育過夜．次日用TBST洗3次膜，每次10 min；室溫下二抗孵育1 h，TBST洗3次膜，每次10 min；隨后將PVDF膜用ECL超敏發光液避光孵育1 min，置于凝膠成像儀(Bio-Rad，17001402，ChemiDOC MP Imaging System)中顯影．

1.2.6 MTT法檢測 待細胞生長到對數生長期時，使用胰蛋白酶消化細胞，按照每孔1 000個細胞鋪于96孔板，每種細胞設置7組，每組設置6個復孔，置于培養箱中孵育，分別對應檢測1、2、3、4、5、6、7 d的細胞增殖情況．每隔24 h孵育結束，在每孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，放入培養箱孵育4 h后，吸去上清，在每孔加入150 μL DMSO，置于96孔板搖床振搖15 min，用酶標儀(Tecan，Infinite 200 pro)檢測490 nm波長處的吸光度．

1.2.7 細胞劃痕實驗 將細胞接種到6孔板中，待其密度達到80%～90%時，使用200 μL黃色吸頭去除單層細胞，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次以去除細胞碎片，倒置顯微鏡(Olympus公司，U-RFL-T)拍照記錄劃痕距離．培養箱中孵育24 h后拍照觀察細胞遷移并測定距離．在每個孔中隨機選3個區域進行分析，通過計算傷口愈合面積百分比來量化細胞遷移能力．

1.2.8 Transwell細胞遷移實驗 將細胞用不含FBS的1640培養基培養24 h后，用胰蛋白酶消化，以2.5×104個/mL的密度重懸于不含有FBS的1640培養基中，從中取200 μL置于Transwell 小室(Corning Costar公司)的上隔室且在下隔室中加入含有10% FBS的1640培養基500 μL，置于培養箱中孵育24 h后，用棉簽擦去膜上表面的細胞，將下表面的細胞用4%多聚甲醛固定30 min，隨后用0.5%結晶紫溶液染色15 min，PBS清洗多余的結晶紫，置于倒置顯微鏡下拍照并計算遷移率．

1.2.9 統計學分析 使用軟件GraphPad Prism 8.0及Image J對數據進行處理，結果以均值±標準差表示，兩組間差異比較采用t檢驗，以P<0.05 為有顯著性差異．

2 實驗結果

2.1 SLC44A5在人體內表達情況

通過NCBI公共數據庫檢索SLC44A5在全身各器官中的表達情況，結果如圖1所示，可以觀察到，雖然SLC44A5在其他組織中表達量較低或者不表達，但在胎盤、全腦中相對高表達．

圖1 SLC44A5在各器官中的表達

2.2 SLC44A5低表達細胞模型構建

為了驗證SLC44A5與肺腺癌細胞生長能力和遷移能力之間的關系，本文按照載體構建的方法來構建SLC44A5低表達載體．首先設計了3組SLC44A5的SiRNA，SiRNA序列見表1．為了篩選SiRNA，將3組SiRNA序列轉染到野生型肺腺癌細胞H1299中．轉染48 h后，利用qPCR考察H1299細胞中SLC44A5的敲降效率R．結果如圖2(a)所示，Si1序列敲降效率較高，為77%，最終選取該序列為構建shRNA敲降載體的候選序列．

表1 SLC44A5 SiRNA序列

隨后分別用濃度為31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000 μg/mL的G418作用于H1299細胞，通過MTT法得出72 h時G418對細胞的殺傷作用，結果如圖2(b)所示，濃度為2 000、4 000、8 000 μg/mL的G418細胞存活率V均為10%，組間無顯著差異，因此最終選擇2 000 μg/mL 為合適的G418濃度．

根據1.2.4實驗方法構建SLC44A5低表達細胞模型，隨后利用Western Blot檢測4種細胞中SLC44A5蛋白的表達情況．結果如圖2(c)所示，與對照組相比，H1299 shSLC44A5和H1792 shSLC44A5中SLC44A5蛋白表達量降低了．以上結果說明，SLC44A5低表達細胞模型構建成功．

圖2 SLC44A5低表達細胞模型構建

2.3 SLC44A5低表達抑制肺腺癌細胞增殖能力

為了更直觀地觀察敲低SLC44A5對肺腺癌細胞的影響，本研究觀察了H1299對照組、H1299 shSLC44A5、H1792對照組、H1792 shSLC44A5的細胞形態變化．H1299和H1792為上皮樣細胞，呈多邊形形狀．結果如圖3(a)所示，發現SLC44A5低表達，細胞形態并未發生明顯變化，但生長更為分散．

又利用MTT法檢測上述4種細胞生長7 d的細胞存活率來驗證SLC44A5是否對肺腺癌細胞增殖能力產生影響．結果如圖3(b)所示，與對照組相比，SLC44A5低表達可以抑制肺腺癌細胞的生長．

(a) 細胞形態

2.4 SLC44A5低表達抑制肺腺癌細胞遷移能力

通過細胞劃痕實驗和Transwell細胞遷移實驗來檢測SLC44A5對肺腺癌細胞遷移能力的影響．首先將H1299對照組、H1299 shSLC44A5、H1792對照組、H1792 shSLC44A5接種于6孔板，細胞貼壁后進行細胞劃痕實驗，培養24 h后進行拍照，比較0 h和24 h后的傷口面積．結果如圖4(a)所示，SLC44A5低表達，傷口愈合面積顯著減少．

接著將上述4種細胞用無血清1640培養基培養24 h，接種于小室中(5 000/孔)進行Transwell 細胞遷移實驗，24 h后進行拍照對比，比較0 h和24 h后細胞穿過小室的數量．結果如圖4(b)所示，H1299和H1792在敲低SLC44A5的表達后，穿過小室的細胞數量有所減少．

(a) 細胞劃痕實驗結果(p為傷口愈合面積百分比)

上述兩個實驗現象都說明了降低SLC44A5的表達可以抑制肺腺癌細胞的遷移．

3 結果討論

肺癌的發生和發展是一個復雜的過程，涉及細胞生物學過程中多個重要基因的調控．已有的研究表明SLC44A1-5家族的獨特膽堿轉運體存在于各種人類癌細胞中[15]，但膽堿轉運蛋白的表達模式因癌細胞類型而異，且SLC44A5敲低的細胞可通過降低細胞中凋亡標志物caspase-3和caspase-9的表達水平而表現出細胞凋亡，并抑制了侵襲，表明SLC44A5可能是癌癥治療的分子靶點[14]．基于此，通過SLC44A5低表達細胞系H1299 shSLC44A5、H1792 shSLC44A5進行一系列研究，結果發現降低SLC44A5的表達可抑制肺腺癌細胞的生長和遷移能力．因為SLC44A5在肺部表達量少，如果通過抑制SLC44A5表達的方式影響肺腺癌細胞遷移，對正常肺器官造成的影響較?。虼?，針對該靶點設計藥物，在保證療效的情況下副作用較低，有較好的成藥性．

4 結 語

本文實驗結果初步證明，SLC44A5對肺腺癌細胞的生長和遷移發揮了重要作用，可能成為臨床肺腺癌的治療靶點．當然，SLC44A5在肺腺癌中的作用機制研究仍然處于探索階段，要想徹底解決肺腺癌的相關臨床問題，還需要繼續深入探索．