羊肚菌細菌性病害病原菌的分離鑒定

張晨曉，趙書雪,2，曹田田，張燕嬌，郭立忠，于 浩*

(1.青島農業大學生命科學學院，山東青島 266000；2.中國海洋大學環境科學與工程學院，山東青島 266100)

羊肚菌(Morchellasp.)隸屬于子囊菌門(Ascomycota)盤菌綱(Discomycetes)盤菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)[1]。羊肚菌的菌蓋與羊肚相似，故得此名[2]。羊肚菌被視為一種營養價值較高的食藥用菌[3]，子實體除含有粗脂肪、粗纖維、粗蛋白及氨基酸外[4]，還包含多糖等成分，不僅可以抑制腫瘤生長、增強免疫力，還可以助消化[5-6]。羊肚菌越來越受人們喜愛，羊肚菌的市場需求越來越大，但羊肚菌與其他常見食用菌不同，羊肚菌作為子囊菌，因其生長環境要求嚴格，影響羊肚菌產量的因素諸多，目前研究者對羊肚菌的栽培了解尚不完全。Ower[7]發明了采用室內栽培羊肚菌的專利，但2008年發現羊肚菌的產量降低，主要原因是菌種的退化及細菌的污染。

對食用菌危害較為常見的細菌種類有枯草桿菌黏液變種(Bacillussubitilisvar.mucoides)、蠟狀芽孢桿菌黏液變種(Bacilluscereusvar.mucoides)、假單孢桿菌(Pseudomonasspp.)、黃單孢桿菌(Xanthomonasspp.)和歐文氏桿菌(Erwinia.)等[8]。因室外栽培羊肚菌的環境難于控制，環境中存在多種細菌，這對羊肚菌的栽培存在威脅，對細菌而言，羊肚菌子實體生長條件溫濕度適宜，細菌可在整個羊肚菌生產環節影響羊肚菌的生產，尤其是出菇環節的細菌病害尤為明顯，直接影響羊肚菌品質及產量。出菇時，羊肚菌細菌性病害主要是對子實體的侵襲，特別是遭遇高溫高濕天氣時，容易從羊肚菌子實體的菌柄與土壤交接的地方發生細菌性侵染及菌柄部位開始侵襲，被昆蟲嚼食過的受傷部位也是細菌性病害高發的地方。細菌侵染后的培養料和子實體會出現濕斑、濕腐、水漬、酸敗、黏液和腐爛等癥狀[8]。筆者從患病羊肚菌子實體中分離得到3種病原菌，通過侵染，發現菌株YDJ-1對羊肚菌子實體的生長存在威脅，對羊肚菌栽培過程中防御細菌性病害有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3由山東省應用真菌實驗室于羊肚菌患病處分離獲得，羊肚菌菌株G4由山東省應用真菌實驗室從甘肅省隴南市采集的野生羊肚菌菌株分離獲得。

1.2 培養基羊肚菌G4等食用菌使用PDA培養基培養，YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3使用LB培養基培養。

1.3 試驗方法

1.3.1羊肚菌病原菌株的篩選采集及觀察。于青島農業大學羊肚菌栽培的大棚中篩選患病的羊肚菌，記錄羊肚菌的發病癥狀，收集羊肚菌患病子實體及周圍的土壤，作為樣本分離致病的病原菌。將采摘的患病羊肚菌子實體用75%乙醇進行表面消毒，用無菌水沖洗3次，剪切下大小0.5 mm2羊肚菌子實體患病部位，用顯微鏡觀察。

1.3.2羊肚菌患病部位細菌的分離純化。將羊肚菌子實體患病部位加入到離心管中，加入無菌水，振蕩培養30 min，稀釋涂布在LB培養基中，待菌落長出，觀察菌落形態、顏色、邊緣狀態、透明度、表面干濕狀態等特征[9]，挑取不同菌落，擴大培養，提取基因組，擴增16S rRNA鑒定菌株，共篩選得到3個菌株，分別標記為YDJ-1、YDJ-2和YDJ-3。

1.3.3YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3與羊肚菌G4的對峙研究。將過夜培養的YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3分別離心，收集菌體，將菌株的OD設定為OD6006.0，將羊肚菌G4打菌餅接種于平板中間，YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3放在與菌餅相距2 cm處，以不加細菌的為對照，觀察羊肚菌菌絲的生長狀態。

1.3.4YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3對羊肚菌G4的侵染。采摘新鮮無病害的羊肚菌子實體，在羊肚菌子實體的菌蓋、菌柄處用手術刀切割長度5 mm的傷口，取200 μL的菌液滴加在傷口處，以添加0.9%生理鹽水作為對照，每個3個重復[10-11]，將侵染后的子實體放回大棚內繼續培養，每12 h觀察一次侵染結果，觀察6 d。

1.3.53株病原菌對羊肚菌不同方式的侵染。參考“1.3.4”方法將3個病原菌接種到正在生長的羊肚菌子實體上，采用2種方法進行侵染，第一種將YDJ-1分別侵染到羊肚菌子實體菌蓋及菌柄處，第二種將YDJ-1滴加到羊肚菌子實體的周圍，觀察羊肚菌子實體的狀態。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌患病菌株的采集與鑒定與正常生長的羊肚菌比較，發現一些羊肚菌菌柄發紅，不規則，輕輕捏菌柄觸感軟塌，有輕微出水現象，輕嗅有臭味，菌蓋較正常生長得小，采摘后，于實驗室分離鑒定病原菌。輕捏菌柄觸感軟塌，有輕微出水現象，輕嗅有臭味(圖1a)，分離得到3株病原菌YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3(圖1b)，菌株的形態特征見表1。通過革蘭氏染色發現菌株YDJ-1和YDJ-2為革蘭氏陰性菌，YDJ-3為革蘭氏陽性菌。通過PCR鑒定，比對發現菌株YDJ-1屬于Pseudomonas(假單孢菌屬)；菌株YDJ-2屬于Buttiauxella(布丘氏菌屬)；菌株YDJ-3屬于Microbacterium(微細菌屬)。

注：a為患病羊肚菌的子實體；b為分離獲得的病原菌，1為YDJ-1菌株，2為YDJ-2菌株，3為YDJ-3菌株

表1 YDJ-1、YDJ-2和YDJ-3菌落形態特征

2.2 3株病原菌與羊肚菌的對峙情況待羊肚菌與3株病原菌共培養7 d后，觀察羊肚菌菌絲的生長狀況，發現菌株YDJ-1對羊肚菌菌絲生長有抑制作用，菌株YDJ-1與羊肚菌菌絲接觸之處，羊肚菌菌絲出現輕微發紅發褐的現象。菌株YDJ-2和YDJ-3對羊肚菌菌絲的生長無抑制作用(圖2)。

注：1為羊肚菌菌絲對照平板，2為羊肚菌菌絲與YDJ-1對峙平板，3為羊肚菌菌絲與YDJ-2對峙平板，4為羊肚菌菌絲與YDJ-3對峙平板

2.3 3株病原菌侵染羊肚菌新鮮子實體情況將3株病原菌分別接種到羊肚菌的子實體中，觀察病原菌對羊肚菌的侵染情況，發現菌株YDJ-1對離體羊肚菌子實體具有一定的侵染能力，被侵染的羊肚菌子實體菌柄變紅褐色，觸感發黏，輕嗅有細菌的臭味。另外2組細菌的侵染狀況與生理鹽水處理組相近(圖3)。

注：1為生理鹽水處理羊肚菌子實體，2為YDJ-1菌液處理羊肚菌子實體，3為YDJ-2菌液處理羊肚菌子實體，4為YDJ-3菌液處理羊肚菌子實體

2.4 YDJ-1菌株不同侵染方式對羊肚菌子實體的影響菌株YDJ-1對羊肚菌子實體存在致病性，采用2種方式對活體羊肚菌是否會患病進行驗證。采用第一種方式侵染，當培養到第6天，發現被菌株YDJ-1的菌液侵染活體羊肚菌子實體菌蓋和菌柄的羊肚菌生長正常，未出現被侵染現象，推測可能是羊肚菌自身可以抵御外界的侵染。用YDJ-1菌液澆灌羊肚菌子實體周圍土壤，發現有10%羊肚菌子實體出現菌柄發紅、變軟等細菌病害的病癥，推測是YDJ-1侵染作用所致(圖4a-3)。繼續延長菌株的侵染時間，當培養至14 d時，發現有40%的羊肚菌出現發病狀況，子實體菌柄呈紅褐色、有水漬，子實體基本不生長，均為羊肚菌幼菇；未發病的60%子實體，生長畸形、菌柄膨大(圖4b)，進一步說明菌株YDJ-1可抑制羊肚菌的生長。

注：a-1為處理菌蓋的羊肚菌子實體，a-2為處理菌柄的羊肚菌子實體，a-3為處理菌根部土壤的羊肚菌子實體；b為培養14 d時處理菌根部土壤的羊肚菌子實體

3 結論

羊肚菌室外栽培受到環境中病蟲的污染，是羊肚菌減產的重要原因之一[12]，目前關于羊肚菌栽培過程中，真菌性病原菌報道較多，如He等[13]篩選羊肚菌白霉病的病原菌株長毛擬青霉(Paecilomycespenicillatus)，He等[14]篩選出羊肚菌蓋腐病的病原菌Diplo?sporalongispora，常見的羊肚菌重要病原菌還有鐮刀菌屬[15-16]，余苗等[10]報道了由曲霉屬真菌引起的羊肚菌白腐病，該研究通過對患病羊肚菌子實體的分離，篩選到3株細菌，通過培養時間及侵染方式，最終確定菌株YDJ-1(Pseudomonas)為羊肚菌的病原菌。