甘肅省4種蘋果病毒檢測及其分子多樣性分析

郗 征，李世帆，王 輝，李恩琛，邵 欣，陳雅寒，徐秉良

(1.甘肅農業大學 植物保護學院，蘭州 730070；2.甘肅臨夏州森林病蟲害防治檢疫站,甘肅臨夏 731100)

蘋果(MaluspumilaMill.)為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)落葉喬木[1]，果實具有營養價值高、耐貯性好和供應周期長的特點[2]，在全世界范圍內廣泛栽培[3]。據聯合國糧農組織(http://www.fao.org/faostat/zh/#data)和國家統計局(https://data.stats.gov.cn/easyquery.htm?cn=C01)數據計算，2019年中國蘋果總栽培面積和產量分別占世界總量的41.9%和 48.6%，均居世界第一。目前黃土高原產區為中國最大蘋果生產區[4]，甘肅省是該區第二大生產省份，2016年年產量達360.13萬t，居全國第5位[5]。

蘋果病毒病目前在中國的蘋果產區均有發生[6]，其中在甘肅省部分蘋果主產區發生率較高[7-10]。蘋果樹受病毒侵染后，可導致樹勢衰弱，葉片縮小、褪綠葉斑，果實銹斑、花臉或畸形等，造成果實品質和產量下降[11-14]。病原主要由帶毒接穗、砧木通過嫁接傳播[12]，通過苗木和接穗的調運遠距離傳播[15]。果樹感病后終生帶毒[16]，目前尚無有效的治療藥劑，培育無毒苗木是目前國內防治蘋果病毒病的有效手段。隨著蘋果“矮砧密植”栽培方式的推廣，經由帶毒接穗傳播病毒并危害蘋果生產的風險愈發嚴峻[15]。因此，盡早明確各蘋果產區病毒發生情況和病毒的基因信息將為病毒病的防治奠定基礎。中國已經明確鑒定的蘋果病毒約有20種[13,17-19]，根據病毒侵染后是否在栽培品種上表現癥狀可將病原分為非潛隱性病毒和潛隱性病毒[20]，主要發生的有：蘋果壞死花葉病毒(Apple necrosis mosaic virus，ApNMV)[21]和蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)[22]2種非潛隱性病毒；蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)[23-24]、蘋果莖溝病毒(Applestem grooving virus，ASGV)[24-25]、蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)3種潛隱性病毒[10,24]。李屬壞死環斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV)在中國主要危害櫻桃、桃等薔薇科李屬(Prunus)植物[26]，該病毒侵染蘋果，可能為引起蘋果花葉病毒的病原[27-28]。雖然2011-2017年甘肅省蘋果產區已經開展過ApNMV、ASGV、ASPV、和ACLSV等病毒發生情況的研究[7-10,21]，但是近5年隨該省蘋果種植面積不斷擴大和新品種的引進，蘋果病毒病種類、發生及分子變異情況尚不明確。

本研究對甘肅省隴南、天水、平涼、蘭州和白銀5市蘋果產區采集的93份葉片樣品進行RT-PCR鑒定，以了解甘肅省蘋果產區內ASGV、ASSVd、ACLSV和PNRSV病毒發生狀況；對優勢種ASGV的cp基因片段進行序列分析，明確甘肅省蘋果主產區內ASGV分類地位和分子變異情況，以期為蘋果病毒病的科學防控策略提供有效信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年5月至10月，分別在甘肅省蘋果產區果園內隨機采集蘋果葉片，樣品信息如下：隴南市禮縣曾家村(5份‘富士’)，天水市秦州區天水鎮(9份‘富士’)、秦安縣葉堡鄉(3個果園共33份‘富士’)，平涼市靜寧縣德美示范基地(10份‘蜜脆’)、靜寧縣李溝村(7份‘富士’)，蘭州市西固區馬家山村(3份‘富士’，21份‘花牛’)，白銀市靖遠縣(5份‘富士’)，共計93個樣品。葉片用自封袋密封放入裝有干冰的泡沫箱內帶回實驗室，經液氮研磨至2 mL無酶離心管內，放入-80 ℃冰箱內保存。

1.2 樣品RT-PCR鑒定

反轉錄反應：使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)，以1 μg植物總RNA為模板，反應體系為Oligo(dT)Primer(50 μmol/L)1 μL、5× PrimeScript Buffer 4 μL、PrimeScript RT EnzymeMixⅠ 1 μL、Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL、Total RNA 1 μL、RNase Free dH2O 12 μL。混勻后，37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，產物用10 μL ddH2O稀釋，-20 ℃保存，備用。

PCR擴增鑒定：檢測引物均參考已發表引物(表1)，由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成。反應體系為模板cDNA 2.0 μL、Forward Primer(10 μmol/L)1.0 μL、Reverse Primer(10 μmol/L)1.0 μL、TaqMix 12 μL、ddH2O補至25 μL。PCR擴增程序為94 ℃ 預變性3 min，94 ℃變性30 s，對應引物退火溫度退火30 s，72 ℃延伸至對應擴增片段時間，35個循環，72 ℃ 10 min。反應結束后取5 μL產物，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(預先加入0.01%綠色熒光核酸染液，Solarbio)。

表1 蘋果病毒病RT-PCR檢測引物

1.3 ASGVcp片段擴增、克隆及測序

采用上述步驟提取蘋果葉片總RNA和進行反轉錄，利用引物對ASGV-F/R，擴增ASGVcp基因片段。反應體系為cDNA 2 μL、Forward Primer(10 μmol/L)1 μL、Reverse Primer(10 μmol/L)1 μL、TaqMix 12 μL、ddH2O補至25 μL。PCR擴增程序為94 ℃ 預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環，72 ℃ 10 min。反應結束后取5 μL產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，經瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收[天根生化科技(北京)有限公司]的產物，與pMD19-T Vector(TaKaRa)連接，轉化至大腸桿菌DH5 α感受態細胞[天根生化科技(北京)有限公司]，涂布在LB 固體培養基(含50 mg/L Amp)上，37 ℃培養過夜，將PCR鑒定為陽性的菌液送往西安擎科澤西生物科技有限責任公司測序，3次重復。

1.4 ASGV cp序列分析

采用Vector NTI Advance 11軟件對測序結果進行校正拼接，將得到的ASGVcp基因片段與GenBank登錄的34個來源不同的ASGV分離物基因序列進行系統發育分析，以櫻桃病毒A(Cherry virus A，CVA)cp基因序列(登錄號：NC_003689.1)作為外群。利用MEGA X軟件中的CLUSTAL W算法比對序列，用鄰接法(Neighbour-joining，NJ)構建系統進化樹，自展值設置為1 000。系統進化樹顯示閾值為50%。

2 結果與分析

2.1 甘肅省蘋果病毒發生分析

2.1.1 蘋果病毒在不同產區和栽培品種上的發生情況 在甘肅隴南、天水、平涼、蘭州和白銀市蘋果產區果園內隨機取樣93份樣品，通過RT-PCR技術對采集到的蘋果葉片進行檢測發現(表2)，ASGV檢出率最高，在全部采集果園內均有發生，平均檢出率達到87.1%，其中有6個果園的檢出率達100%，ASGV成為危害甘肅省蘋果生產的主要病毒。ASSVd、ACLSV和PNRSV在甘肅省均有發生，平均檢出率分別為41.9%、10.7%和11.8%。天水市4種蘋果病毒檢出率較高，在所調查的兩地4種病毒均有檢出；在平涼靜寧縣德美示范基地的蘋果園中ASSVd檢出率達90.0%，遠高于其他調查果園。病毒病發生情況調查發現，所有93份樣品中(48份‘富士’，26份‘花牛’，10份‘蜜脆’和9份‘元帥’)，不同品種的各病毒檢出率差異不明顯，ASGV在各個栽培品種中均為優勢種(圖1)。

表2 甘肅省各地區蘋果病毒病發生率

2.1.2 甘肅省蘋果病毒復合侵染情況 在所調查的93份蘋果葉片樣品中，ASGV單一侵染的有34份，檢出率為36.6%。靜寧縣李溝村只檢測到ASGV，其余所調查的果園均發生不同程度復合侵染。所有檢測樣品中共7種復合侵染類型。“ASGV+ASSVd”為主要復合侵染類型(表3)，檢出率達37.6%，其余2種病毒復合侵染類型和檢出率分別為：“ASGV+PNRSV”，4.3%；“ASGV+ACLSV”，3.2%；“ASSVd+ACLSV”，2.2%。3種病毒復合侵染：“ASGV+ASSVd+ACLSV”，4.3%；“ASGV+ASSVd+PNRSV”，4.3%。4種病毒復合侵染：“ASGV+ASSVd+ACLSV+PNRSV”，3.2%。天水、蘭州和白銀市復合侵染發生情況最為嚴重，每個調查地至少發生3種病毒的復合侵染(圖1)。

表3 蘋果病毒單一或復合侵染類型和檢出率

2.2 ASGV cp序列系統發育分析

通過對測序片段進行拼接校正，共得到4個ASGV cp片段序列：A29(富士，天水市秦州區天水鎮)、A39(富士，天水市秦安葉堡鄉)、A42(富士，天水市秦安縣葉堡鄉)和A80(花牛，蘭州市馬家山村)，利用NCBI在線工具BLASTn進行多序列比對，將4個序列與GenBank登錄的34個ASGV分離物基因序列進行系統發育分析，以櫻桃病毒A的cp基因序列作為外群。通過分析得到的系統發育樹發現(圖2)，38個ASGV分離物cp基因序列被聚為3個組，組Ⅰ內包含35個分離物，被進一步分為2個亞組，亞組Ⅰ-Ⅰ包含A29、A39、A42和A80在內的22個分離物，其中A29與來自中國云南蘋果的ML-1分離物遺傳距離最近，共聚為同一支，cp基因核酸序列同源性為99.2%，A39與A42聚為一支，兩者與來自中國陜西蘋果的YL06分離物核酸序列同源性為97.1%和96.9%，A80單獨成一簇并與A39、A42、YL06、CO-kr1、GW-JS和TJX-1聚在同一支；亞組Ⅰ-Ⅱ包含13個分離物。組Ⅱ僅有一支來自中國河南的梨分離物P-L2。組Ⅲ內包含來自印度的梨分離物pear in India和獼猴桃分離物Ki-1。

3 討 論

本研究調查發現：ASGV檢出率為87.1%，在甘肅省蘋果產區普遍發生；ASSVd、ACLSV和PNRSV在甘肅省均有發生，檢出率分別為 41.9%、10.7%和11.8%；甘肅省蘋果病毒以“ASGV+ASSVd”為主要復合侵染類型，檢出率為36.6%。冀志蕊[10]在2011年對蘭州、平涼(涇川縣)的20份蘋果幼嫩枝條檢測發現，ASPV和ACLSV平均檢出率分別為75.0%和60.0%，蘭州ASGV檢出率達80%；張明珍[9]在2013年對蘭州蘋果種植園8個蘋果冬芽樣品檢測發現，ACLSV、ASGV和ASPV的帶毒率分別為 87.5%、62.5%和50%，3種病毒的復合侵染率達37.5%；李幗英等[8]在2012-2014年調查發現，天水蘋果主產區36個果園中ACLSV和AGSV陽性率較高，分別為61.1%和58.3%，樣品平均帶毒率為83.3%。前人調查結論與本研究相似，目前，甘肅省各蘋果產區ASGV、ASSVd、ACLSV和PNRSV 4種病毒病發生普遍，復合侵染類型多樣化，蘭州和天水市蘋果病毒危害最為嚴重，ASGV逐漸成為危害甘肅省蘋果生產的主要病毒。由于蘋果“矮砧密植”栽培方式的推廣，并且ASGV的潛隱性危害特性使得癥狀識別變得困難，可能使大量帶毒接穗嫁接到健康砧木而造成廣泛而嚴重的危害，應當引起重視。

4個源自甘肅蘋果ASGV分離物cp基因與GenBank所登錄的來源不同的34個分離物的系統進化分析表明，在基于38個ASGV分離物的cp基因序列所構建的系統發育樹中，分離物A29、A39、A42和A80均聚在同一亞組Ⅰ-Ⅰ內，甘肅4個分離物都與來自中國陜西、云南蘋果的分離物有較高的核酸序列同源性，亞組Ⅰ-Ⅰ內的22個分離物中有16個來自蘋果，說明ASGV的cp基因變異可能具有寄主相關性，但在亞組Ⅰ-Ⅱ內寄主相關并不明顯；全部38個分離物分屬6個國家的不同地區，中國蘋果分離物均來自本國蘋果主產區，系統發育分析和cp基因核酸序列同源性均無法分辨出分離物的地理來源規律。

目前，對ASGV分離物分子變異的寄主相關性和地理關聯性上的研究結果分歧較大，姬盼等[32]認為，ASGV分子變異存在寄主和地理關聯；而李正男等[33]、Hu等[34]的分析發現，ASGV不同分離物并無寄主專一性與地理分布規律。Liebenberg等[35]和張雪嬌等[36]研究發現，ASGV遺傳進化具有寄主相關性而無地理關聯；Kim等[37]發現來自蘋果與梨的ASGV分離物的cp基因序列在核苷酸和氨基酸水平上具有與宿主相對應的系統發育差異。分析樣本較少可能是導致結論不同的原因之一，并且由于果樹特殊的栽培方式而導致經帶毒接穗、嫁接傳毒和與帶毒砧木病毒間基因重組的發生，使得不同地域和寄主間病毒交流廣泛，造成對ASGV不同寄主和地域分離物相關性判定的誤差。GenBank中所登錄的ASGV分離物的序列信息主要來自中國，其次來自印度、韓國和日本等國，且在中國境內所登錄的蘋果分離物主要來自于陜西和山東等省，尚缺乏中國蘋果四大主產區廣泛的序列信息，這使得對ASGV的分子變異分析變得困難。本研究明確了ASGV甘肅蘋果分離物的分類地位，是對中國ASGV發生情況和群體多樣性的有力補充。