蘭州大尾羊脂聯素及其受體基因全長cDNA克隆與表達模式分析

張德榮，孫渭博，曹 忻，李羽翡，柏家林

(1.西北民族大學 生物醫學研究中心，蘭州 730030；2.甘肅農業大學 動物科學技術學院，蘭州 730070；3.西北民族大學 實驗教學部，蘭州 730030；4.甘肅省食品檢驗研究院，蘭州 730070)

脂聯素(adiponectin, APN)，也稱脂肪連接蛋白，是由脂肪細胞分泌的一種具有生物活性的內源性多肽或蛋白質(一種具有保護作用的脂肪因子)，由N端信號肽、變異區域、N-膠原蛋白三螺旋區和C端球狀區4 個結構域構成[1]。脂聯素由APN基因編碼，該基因最早定位在人類染色體的3q27，全長17 kb，在哺乳動物中高度保守，由3個外顯子和2個內含子組成，編碼247個氨基酸(外顯子1不參與編碼蛋白)，編碼的APN蛋白分子質量約為30 ku[2-3]。脂聯素前體經加工修飾可形成低分子質量(low-molecular-weight, LMW)蛋白與高分子質量(hight-molecular-weight, HMW)蛋白，兩者在機體內具有獨特的生物學功能[4-5]。作為一種脂肪細胞因子，脂聯素必須與靶器官上的特異性受體結合才能發揮其生物學功能，Yamauchi等[6]研究表明脂聯素存在脂聯素受體1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)和脂聯素受體2(adiponectin receptor 2,AdipoR2)兩種亞型受體。AdipoRs含有7 個跨膜結構域，但結構和功能上完全不同于G蛋白偶聯受體，AdipoR1基因主要在骨骼肌組織中表達，對脂聯素球狀區有高度親和力；AdipoR2基因主要在脂肪和肝臟組織中表達，對全長、球形脂聯素有中度親和力，APN基因通過與AdipoRs結合直接參與腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase, AMPK)和過氧化物酶體增殖物激活受體-α(Peroxisome Proliferators-activated Receptor α, PPAR-α)途徑，間接調節脂肪酸氧化、葡萄糖利用和糖異生等代謝及胰島素的分泌[7-8]。APN基因的研究主要集中在人及嚙齒動物，如人類肥胖、脂質代謝及胰島素耐受等。在家畜動物中，陳星伊等[9]研究發現AdipoR1和AdipoR2基因參與秦川牛肌肉生長發育的調控；孟憲然等[10]在研究內蒙古絨山羊時發現APN基因是影響肉品質的重要候選基因；An等[11]研究表明APN基因影響綿羊早期生長速度、瘦肉量及胴體脂肪沉積深度等。此外，人們最初認為成熟的脂肪細胞是脂聯素蛋白合成和分泌的唯一場所，但在后續的研究中發現，其在多種哺乳動物的心肌、垂體、成骨細胞、卵巢等組織中均有不同程度的表達[12]。因此，本研究以蘭州大尾羊為試驗對象，同源克隆和RACE克隆APN、AdipoR1和AdipoR2基因的全長cDNA序列，運用實時熒光定量PCR技術分析脂聯素及其受體基因在15種組織中的表達規律，為下一步開展綿羊脂聯素及其受體在多克隆抗體制備及免疫組化等方面機制機理的研究打下基礎，為后期開展的相關研究提供必要的理論依據與數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇3只健康且體況良好的6月齡蘭州大尾羊(甘肅省永靖縣瑞霖科技養殖有限公司)，經頸靜脈放血處死后，無菌條件下采集15種組織：背最長肌、肩部皮下脂肪、內臟脂肪、肝臟、腎臟、心臟、肺、脾、卵巢、睪丸、大腸、小腸、間腦、瘤胃和皺胃，將組織分割為1 cm3的小塊，裝入標記好的凍存管置于液氮中帶回實驗室，-80 ℃冰箱保存。

1.2 RNA提取與反轉錄

采用Takara RNAiso Plus總RNA 提取試劑盒分別提取15種組織總RNA，產物溶于DEPC水，-80 ℃保存，備用。采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification試劑盒對背最長肌、肩部皮下脂肪和肝臟組織中提取的總RNA進行反轉錄合成cDNA第一鏈，產物-20 ℃保存，備用。采用All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒分別將15種組織中提取的總RNA進行反轉錄合成cDNA，產物于-20 ℃保存，備用。

1.3 引物設計與合成

1.3.1 簡并引物設計與合成 根據人、鼠、大鼠、牛、山羊、雞和豬的脂聯素及其受體基因序列同源性比較結果，運用PrimerPrimer 5.0 軟件設計其同源克隆的上下游引物，具體序列及產物大小見表1，引物由生工生物工程有限公司合成。

表1 綿羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因同源克隆引物序列

1.3.2 RACE引物設計與合成 根據綿羊脂聯素及其受體同源克隆基因片段測序結果，運用PrimerPrimer 5.0軟件設計其5′-RACE 特異性引物(Gene Specific Primer, GSP)和3′-RACE特異性引物。再依據綿羊脂聯素及其受體RACE克隆測序結果，拼接全長cDNA序列，設計相應的驗證PCR引物，具體引物序列及產物大小見表2，引物由生工生物工程有限公司合成。

表2 綿羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因RACE特異引物及驗證PCR引物

1.3.3 實時熒光定量PCR引物設計與合成 根據RACE克隆出的APN、AdipoR1和AdipoR2基因全長cDNA 序列，運用PrimerPrimer 5.0軟件設計實時熒光定量PCR引物，以綿羊3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase,GAPDH)作為內參基因(NM_001190390)，具體序列及產物大小見表3，引物由生工生物工程有限公司合成。

表3 綿羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因組織特異性qPCR引物

1.4 綿羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因克隆

1.4.1 同源克隆 分別取背最長肌、肩部皮下脂肪和肝臟組織cDNA 第一鏈稀釋液2.0 μL，脂聯素及其受體基因上、下游引物各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，TakaRaTaqDNA聚合酶1.5 μL，加雙蒸水至25 μL。運用Touchdown PCR技術，分別擴增APN、AdipoR1和AdipoR2基因同源片段，具體反應條件見表4。PCR產物運用1 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表4 綿羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因同源片段擴增條件

1.4.2 RACE克隆 分別以背最長肌、肩部皮下脂肪和肝臟組織總RNA反轉錄的第一鏈cDNA為模板，RACE克隆APN、AdipoR1和AdipoR2基因。RACE克隆反應體系(50 μL)為cDNA模板2.5 μL，10×UPM 5 μL，5′-RACE GSP1 1 μL，3′-RACE GSP1 1 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix 1 μL，50×Advantage 2 Ploymerase Mix 1 μL和PCR-Grade Water 33.5 μL。APN基因5′-RACE和3′-RACE反應條件為：94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25個循環。AdipoR1基因5′-RACE反應條件為：94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25 cycles；3′-RACE反應采用Touchdown PCR技術，反應條件為：94 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5個循環；94 ℃、30 s，70 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5個循環，94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25 個循環。AdipoR2基因5′-RACE反應采用Touchdown PCR 技術，反應條件為：94 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5個循環；94 ℃、30 s，70 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5個循環，94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25個循環；3′RACE 反應條件為：94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25個循環。反應結束后，PCR產物用1 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用TakaRa MinREST Gel DNA Extraction Kit(Ver.3.0)進行目標產物回收，并構建克隆載體測序。

1.4.3 PCR驗證 分別以背最長肌、肩部皮下脂肪和肝臟組織總RNA反轉錄的第一鏈cDNA為模板，PCR擴增APN、AdipoR1和AdipoR2基因。PCR擴增反應體系(20 μL)為cDNA模板1 μL，驗證上游引物1 μL，驗證下游引物1 μL，dNTP Mix 1 μL，TaKaRa LATaq0.5 μL，10×Buffer 2 μL和PCR-Grade Water 13.5 μL。APN基因PCR反應條件為 95 ℃、2 min；98 ℃、2 min，57 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30個循環；72 ℃、10 min。AdipoR1和AdipoR2基因PCR反應條件為95 ℃、2 min；98 ℃、2 min，60 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30個循環；72 ℃、10 min。反應結束后，PCR產物用0.9 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用TakaRa MinREST Gel DNA Extraction Kit(Ver.3.0)進行目標產物回收，并構建克隆載體測序。

1.4.4 克隆載體構建及測序 選用 TakaRa DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將脂聯素及其受體基因同源克隆、5′-RACE、3′-RACE、驗證 PCR的片段回收并與克隆載體T-V ector pMDTM19 Simple連接，過夜后熱轉化至E.coliCompetent Cell JM109感受態細胞中，涂布平板，37 ℃過夜培養。挑選陽性菌落，提取質粒，送至生工生物工程有限公司使用通用引物進行測序。

1.5 實時熒光定量PCR

分別以15種組織反轉錄所得的cDNA鏈為模板，進行qPCR擴增，反應體系為cDNA模板1 μL、上下游引物各 0.2 μL、2×SYBR qPCR Mix 12.5 μL和DEPC H2O建立25 μL qPCR反應體系，反應條件為94 ℃、2 min，94 ℃、5 s，57 ℃、30 s，40個循環。在LightCycler 480實時熒光定量PCR儀中測定APN、AdipoR1和AdipoR2在15種組織中的表達水平，每個反應重復3次。

1.6 生物信息學分析

從NCBI上分別下載人、鼠、大鼠、牛、山羊、雞和豬等物種對應APN、AdipoR1和AdipoR2基因序列，利用MEGA軟件進行同源性分析。

1.7 數據分析

所有基因在每個樣品(組織)重復進行3次，數據以“平均值±標準差”表示。利用SPSS 22.0軟件進行數據的統計分析，不同組織的脂聯素及其受體基因在其不同濃度下表達量的影響均采用單因子方差分析對其顯著性進行檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 綿羊ANP基因同源克隆、RACE擴增及序列分析

以背最長肌的反轉錄cDNA第一鏈稀釋液為模板，同源克隆出310 bp的ANP基因片段(圖1-A)，再利用RACE技術，克隆出大小為950 bp的5′-RACE片段(圖1-B)和1 500 bp的3′-RACE片段(圖1-C)，拼接獲得全長為2 101 bp的ANP基因cDNA(GenBank登錄號：KJ1592123，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ159213.1)，驗證PCR擴增出大小為1 193 bp的ANP基因片段(圖1-D)。通過MEGA分析顯示，綿羊APN蛋白序列與山羊和牛的相似性較高(圖2)。

2.2 綿羊 AdipoR1基因同源克隆、RACE擴增及序列分析

以肩部皮下脂肪的反轉錄cDNA第一鏈稀釋液為模板，同源克隆出364 bp的AdipoR1基因片段(圖3-A)，再利用RACE技術，克隆出大小為500 bp的5′-RACE片段(圖3-B)和大小為1 600 bp的3′-RACE片段(圖3-C)，拼接獲得全長為2 035 bp的AdipoR1基因cDNA序列(GenBank登錄號：KJ159212，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ159212.1)，驗證PCR擴增出大小為1 100 bp的AdipoR1基因片段(圖3-D)。通過MEGA分析顯示，綿羊AdipoR1蛋白序列與山羊、牛、人、小鼠、大鼠和豬的相似性較高，而與雞的相似性最低(圖4)。

2.3 綿羊 AdipoR2基因同源克隆、RACE擴增及序列分析

以肝臟組織的反轉錄cDNA第一鏈稀釋液為模板，同源克隆出綿羊AdipoR2基因大小為550 bp的同源片段(圖5-A)；再利用RACE技術克隆出大小為1 100 bp的5′-RACE片段(圖5-B)和700 bp的3′-RACE片段(圖5-C)，拼接獲得全長為1 809 bp的綿羊AdipoR2基因cDNA序列(GenBank登錄號為：KF921623，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF921623.1)，驗證 PCR 擴增出約1 100 bp的AdipoR2基因片段(圖5-D)。通過MEGA分析顯示，綿羊AdipoR2蛋白序列與山羊、牛、小鼠、大鼠、雞和豬的相似性較高，而與人的相似性最低(圖6)。

2.4 綿羊APN基因在15種組織中的相對表 達量

通過實時熒光定量技術檢測綿羊ANP基因在15種組織樣品中的相對表達量，結果見圖7。結果表明，蘭州大尾羊APN基因在15種組織中均有表達。其中，在背最長肌中的相對表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，其次是在心臟和瘤胃組織；在其他組織中相對表達量較低，差異不顯著，在肩部皮下脂肪中的相對表達量最低。

2.5 綿羊 AdipoR1基因在15種組織中的相對表達量

通過實時熒光定量技術檢測綿羊AdipoR1基因在15種組織樣品中的相對表達量，結果見圖8。結果表明蘭州大尾羊AdipoR1基因在15種組織中均有表達。其中，在內臟脂肪和肩部皮下脂肪中的相對表達量最高，兩者間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他組織(P<0.05)；其次是脾臟、心臟、小腸、大腸、肝臟、肌肉和皺胃組織；在其他組織中相對表達量較低，差異不顯著，在間腦組織中的相對表達量最低。

2.6 綿羊 AdipoR2基因在15種組織中的相對表達量

通過實時熒光定量技術檢測綿羊AdipoR2基因在15種組織樣品中的相對表達量，結果見圖9。結果表明蘭州大尾羊AdipoR2基因在15種組織中均有表達。其中，在內臟脂肪中的表達量最高，其次是肩部皮下脂肪，與肝臟、心臟、脾臟、大腸、小腸、皺胃等其他組織中表達量相比，差異極顯著(P<0.01)，而在卵巢、睪丸、肺、腎臟、間腦、瘤胃中幾乎不表達。

3 討 論

研究表明APN基因經磷酸絡氨酸銜接蛋白(phosphotyrosine interactingwith PH domain and leucine zipper 1, APPL1)作用后，可與脂聯素受體特異性結合，激活AMPK、PPARα和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路進行下游糖類和脂肪代謝調節，從而發揮生物學功效[13-14]。APN基因在抗氧化[15]、抗消炎[16]、抗動脈粥硬化[17]、II型糖尿病[18]和胰島素拮抗[19]以及心血管疾病[20]等方面發揮著重要的調節作用，其表達水平的變化直接影響游離脂肪酸和抑制炎癥細胞因子的表達合成[21]，導致肥胖、心血管疾病和II型糖尿病等代謝綜合癥的發生[22]，說明該基因對人與畜禽的脂類代謝及相關疾病有著重要的影響。但綿羊APN基因的相關研究報道較少，而被譽為“長尾脂型”典型代表的蘭州大尾羊[23]是研究肥胖、糖尿病等代謝疾病的最好載體，對其進行生脂機理調控研究和改善肉質水平有重要的參考價值。

本研究采集蘭州大尾羊背最長肌、肩部皮下脂肪和肝臟組織，同源克隆出綿羊APN、AdipoR1及AdipoR2基因cDNA，在此基礎上運用RACE技術克隆綿羊APN、AdipoR1及AdipoR2基因5′-UTR和3′-UTR區域，隨后分別進行拼接得到2 101 bp、2 035 bp和1 809 bp的全長APN、AdipoR1及AdipoR2基因，并利用PCR驗證完整性。

最初人們認為脂聯素只在脂肪細胞中表達，但后來的研究發現脂聯素在其他非脂肪細胞中也能表達。在人肝細胞、小鼠成骨細胞和破骨細胞、體外培養的骨骼肌細胞、豬胎盤和子宮、結腸黏液細胞、唾液腺上皮細胞、肌細胞、肌成纖維細胞等中均檢測到脂聯素的表達[24]。Ding等[25]通過克隆豬的APN基因并測定APN及其受體基因在不同組織中的表達量發現，APN基因和AdipoR2基因在皮下脂肪組織中大量表達，AdipoR2基因在肝臟、心臟、骨骼肌和脾臟組織中少量表達；AdipoR1基因在心臟和骨骼肌中大量表達，在脂肪、肝臟和脾臟組織中少量表達。Smolinska等[26]研究發現脂聯素可通過影響豬發情周期中的子宮情況來調控豬的繁殖，并且發現脂聯素及其受體基因和蛋白在豬妊娠早期的子宮、孕體和滋養層中均有表達，且在妊娠的不同時期表達量存在差異。張賽賽[27]研究發現，APN基因在小尾寒羊和杜泊羊中呈現出組織表達特異性，不同組織間，APN基因在皮下脂肪、腎周脂肪、腹股溝脂肪、臂二頭肌、心血管組織中有表達，在肝臟、腎臟、卵巢組織中未檢測到表達，提示APN基因的表達有一定的組織特異性，而且脂肪組織中的表達水平極顯著高于其他組織，但在脂肪組織間無差異。李雪梅等[5]研究發現脂聯素基因在藏山羊的脂肪組織中高表達，而在肌肉組織和胃中表達量較低，在心臟、肝臟和脾臟等組織中未檢測到。本研究發現APN基因在肌肉、心臟和皺胃組織中高表達，在其余組織中少量表達；AdipoR1基因在內臟脂肪、皮下脂肪、脾臟、心臟、小腸、大腸、肝臟、皺胃和肌肉組織中高表達，在其余組織中少量表達；AdipoR2基因在內臟脂肪和皮下脂肪組織中高表達，在其余組織中表達量很低，幾乎不表達。研究結果表明脂聯素及其受體基因雖然在不同的組織中均存在一定程度的表達，盡管在同源性較高的物種間，其表達也存在明顯的區別，這應與各物種的起源、衍變過程及生存環境等息息相關。APN基因在肌肉組織中高表達表明其可能參與肌肉中糖脂代謝及胰島素敏感性調節等。AdipoR1和AdipoR2基因在脂肪組織中高表達，說明兩者在脂肪組織中發揮至關重要的作用，可能參與脂肪細胞的分化、葡萄糖及脂肪酸的代謝等[28-29]，此外，在大腸、小腸、瘤胃及皺胃組織中均檢測到APN和AdipoR1基因的表達，推斷其在蘭州大尾羊的消化吸收過程中存在特殊作用，但相關研究較少，需進一步驗證。

4 結 論

本研究通過同源克隆及RACE克隆技術得到綿羊ANP、AdipoR1和AdipoR2基因的cDNA全長分別為2 101 bp、2 035 bp和1 809 bp。在蘭州大尾羊中，APN基因在肌肉組織中高表達，AdipoR1和AdipoR2基因在內臟脂肪和皮下脂肪中高表達。