苦蕎查爾酮合成酶多克隆抗體制備及組織表達(dá)分析

李 蒙，陳 鵬

(1.西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，西安 710065；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

苦蕎(Fagopyrumtataricum)屬于雙子葉廖科1 a生草本植物，是重要的藥食同源作物，含有豐富的黃酮類化合物，其中蘆丁含量最高達(dá)80%[1]。黃酮類化合物不僅可使植物免遭病蟲(chóng)、真菌、細(xì)菌的傷害[2-3]，而且可以預(yù)防癌癥、冠心病、中風(fēng)等疾病[4-5]，對(duì)滿足當(dāng)前人們營(yíng)養(yǎng)需求具有重要作用，因此，苦蕎黃酮類化合物相關(guān)合成酶已經(jīng)成為學(xué)者們研究的焦點(diǎn)。

苦蕎查爾酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)是催化植物多酚類物質(zhì)生物合成途徑的關(guān)鍵酶[6]。催化4-香豆酸-CoA(4-hydroxycin-namoyl-CoA)和丙二酰-CoA(malony-CoA)反應(yīng)，生成花青素、原花青素等黃酮衍生物的起始底物柚皮素查爾酮(naringenin chalcone)[7-8]，為黃酮生物合成代謝提供基本的碳架結(jié)構(gòu)、控制整個(gè)代謝的合成效率。目前CHS已經(jīng)在較多物種中得到深入研究，不同物種中該基因盡管拷貝數(shù)不同但具有較高的同源性，多數(shù)植物還存在CHS基因家族[9]。研究表明，CHS在植物形成花色素的過(guò)程中扮演著重要作用[10-11]，對(duì)CHS基因進(jìn)行RNA干擾從而降低花青素的含量，創(chuàng)造出白色牽牛花和3種不同顏色油點(diǎn)草花瓣[12-13]。同時(shí)，CHS在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中和抗生物脅迫等方面起著重要作用[14]。對(duì)蘋果的研究發(fā)現(xiàn)其基因沉默使葉片縮小和生長(zhǎng)率降低，同時(shí)降低蘋果果實(shí)的黃酮含量[15]。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了苦蕎黃酮類化合物合成過(guò)程中相關(guān)合成酶基因信息，從而篩選與驗(yàn)證相關(guān)合成酶基因?qū)嗍w不同時(shí)期組織生長(zhǎng)發(fā)育的影響[16]，為苦蕎在黃酮類化合物積累的品種改良和天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)與利用起到重要作用。

為進(jìn)一步研究苦蕎黃酮類化合物的代謝機(jī)理，本研究通過(guò)FtCHS基因克隆，并結(jié)合基因重組表達(dá)技術(shù)，制備查耳酮合成酶的多克隆抗體，利用半定量RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平探究FtCHS在苦蕎各器官中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步闡明該基因在苦蕎黃酮類化合物合成過(guò)程中的生物學(xué)功能和分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

苦蕎種子(品系榆6-21，榆林農(nóng)業(yè)學(xué)校提供)種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)大田，開(kāi)花3 d后采集灌漿期樣品種子、葉子、花、莖，立即分裝，液氮速凍于-80 ℃冰箱保存。原核表達(dá)載體pET-28a(+)、大腸桿菌E.coliBL21(DE3)和TOP10均由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 苦蕎總RNA的提取 采用Invitrogen公司的ConcertTMplant RNA Reagent從苦蕎種子中提取總RNA。

1.2.2FtCHS表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)苦蕎查爾酮合成酶(GenBank登錄號(hào):KT284885.1)序列設(shè)計(jì)并合成引物，上游引物F1(5′-CCATGCCATGGGATGTGCATACATGGCTCCATC-3′，下劃線為NcoⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物R1(5′-ACACCGCTCGAGTTGAGCAACCACTGGTACACT GTGT-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)產(chǎn)物回收試劑盒(北京百泰克生物)純化，目的基因和質(zhì)粒pET-28a(+)載體由NcoⅠ/XhoⅠ(Takara公司)進(jìn)行雙酶切，純化目的基因經(jīng)T4DNA Ligase連接到表達(dá)載體pET-28a(+)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒PCR鑒定，陽(yáng)性克隆菌送北京奧科生物測(cè)序，重組質(zhì)粒命名為pET-28a(+)-FtCHS。

1.2.3FtCHS生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)行同源性分析；氨基酸序列比對(duì)應(yīng)用Clustal X2和 genedoc軟件；應(yīng)用ExPASy在線軟件對(duì)其等電點(diǎn)及分子質(zhì)量預(yù)測(cè)；在線SWISS-MODEL三維建模；通過(guò)RNAfold在線分析mRNA翻譯起始區(qū)(-35～+39)二級(jí)結(jié)構(gòu)及自由能分析；利用稀有密碼子在線分析軟件Rare Condon Calculator(RaCC)進(jìn)行基因密碼子分析。

1.2.4FtCHS的表達(dá) 將鑒定的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-FtCHS轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)中表達(dá)。將構(gòu)建好的表達(dá)載體接種到Kana(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至總濃度1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)3 h,收集1.5 mL菌體，加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液懸浮菌體，沸水保溫10 min后離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.5TrCHS表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá) 由于FtCHS未表達(dá)，截去蛋白質(zhì)起始端83個(gè)氨基酸，截短蛋白中保留核心功能域，重新構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TrCHS的E.coliBL21(DE3)表達(dá)菌，重新設(shè)計(jì)上游引物F1(5′-CCATG CCATGG GA TGTGCATACATGGCTCCATC-3′，下劃線為NcoI酶切位點(diǎn))，試驗(yàn)過(guò)程同“1.2.2” 的FtCHS表達(dá)載體構(gòu)建與“1.2.4”的表達(dá)方法，基因和質(zhì)粒pET-28a(+)載體由NcoI/XhoI(Takara公司)進(jìn)行雙酶切，純化目的基因經(jīng)T4DNA Ligase連接到表達(dá)載體pET-28a(+)，將鑒定的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TrCHS轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)中表達(dá)。

1.2.6 TrCHS的分離與純化 TrCHS蛋白的原核表達(dá)，參照文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行，菌液以體積比1∶150接種到新鮮LB培養(yǎng)基(含有50 μg/mL抗生素kana)中，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)，待菌液OD為0.6～0.8時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)劑，使其終濃度為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L和1 mmol/L，分別置于37 ℃、30 ℃、25 ℃和22 ℃搖床中培養(yǎng)，離心管收集誘導(dǎo)后的菌液，8 000 r/min，低溫離心10 min，向收集的菌體(沉淀)中以約1 g(稱量去皮，濕質(zhì)量)加入10 mL的超聲破菌緩沖液，取破碎樣品，12 000 r/min×10 min(4 ℃)，上清和沉淀進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。不可溶的包涵體經(jīng)尿素復(fù)性后經(jīng)鈷離子螯合層析柱純化，參照文獻(xiàn)[18]試驗(yàn)方法，收集TrCHS菌體，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min×15 min，沉淀經(jīng)30 mL 1×PBS(含6 mol/L尿素)混合，緩慢上樣經(jīng)1×PBS平衡的Talon resin柱上，先用1×PBS(含6 mol/L尿素)洗脫雜蛋白，再用含20 mmol/L咪唑的PBS再次洗脫雜蛋白，最后用含150 mmol/L咪唑的PBS洗脫目標(biāo)蛋白。目標(biāo)蛋白經(jīng)pH 8.0的透析液(50 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl)透析后，再通過(guò)PEG 6000濃縮后，電泳檢測(cè)，-20 ℃保存。

1.2.7 TrCHS抗體的制備 鑒定的重組表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-TrCHS進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌體，超聲波破碎，分離與純化后的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析(蛋白質(zhì)marker SM0431,Fermentas)，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色。切取目的條帶，研磨后加入1 mL 0.1 mol/L PBS(pH 7.5)和弗氏不完全佐劑充分溶解[19]、混勻后，免疫大白兔(2～3個(gè)月)。首次免疫劑量為1 mg/只[20]，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射，每隔2周進(jìn)行1 次加強(qiáng)免疫，4 次免疫之后，心臟穿刺取血，分離血清，Western blotting分析抗體的特異性，分別取1 g苦蕎葉、未成熟種子進(jìn)行液氮充分研磨成粉末，加入10 mL蛋白提取緩沖液(10.0 mmol/L Tris-HCl 和25 mmol/L NaCl，pH 7.5)，室溫浸提1 h后12 000 r/min×10 min(4 ℃)離心，上清中含有苦蕎的總蛋白。以原核表達(dá)的融合蛋白為對(duì)照進(jìn)行Western blotting，參照文獻(xiàn)[21]方法進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，-20 ℃凍存，備用。

1.3 FtCHS的組織表達(dá)分析

苦蕎不同組織中CHS的表達(dá)情況分析。FtCHS基因轉(zhuǎn)錄水平分析，提取種子、花、葉子、莖總RNA，設(shè)計(jì)FtCHS基因半定量RT-PCR引物，正向引物F1(5′-GAAGGCGACGAGGCAAGT-3′)，反向引物R1(5′-CGGTCCAAACCCGAACAAG-3′)，內(nèi)參基因FtGAPDH正向引物F2(5′-AGTTGCACTACCAACTGCCTTG-3′)和反向引物R2(5′-AGGTCAACCACGGACACATC-3′)。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。FtCHS基因翻譯水平分析，分別取1 g苦蕎葉、種子、花、莖組織中進(jìn)行液氮充分研磨成粉末，加入10 mL蛋白提取緩沖液(10.0 mmol/L Tris-HCl 和25 mmol/L NaCl，pH 7.5)，室溫浸提1 h后離心，12 000 r/min×10 min(4 ℃)，上清中含有苦蕎的總蛋白。進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡Western blotting方法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FtCHS基因PCR擴(kuò)增與載體構(gòu)建

用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示1 條特異性擴(kuò)增片段(圖1)，與預(yù)期大小1 182 bp基本一致。重組表達(dá)載體經(jīng)PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序，結(jié)果表明FtCHS基因全長(zhǎng)1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸。

2.2 FtCHS序列分析

利用生物信息學(xué)在線軟件計(jì)算重組蛋白的等電點(diǎn)為6.06，理論相對(duì)分子質(zhì)量約44.30 ku。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，α-螺旋占42.63%，β-轉(zhuǎn)角占6.58%，無(wú)規(guī)則卷曲占35.42%，延伸鏈占 15.36%，采用SWISS-MODEL三維結(jié)構(gòu)同源建模(圖2)，其以同源二聚體形式存在，與擬南芥查爾酮合成酶的模型相似度為85.95%，結(jié)構(gòu)分析表明其含有查爾酮合成酶高度保守的活性位點(diǎn)和標(biāo)簽序列GFGPG。

2.3 TrCHS蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒pET-28a(+)-FtCHS轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)，誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE分析，在35.0～45.0 ku未有明顯誘導(dǎo)表達(dá)條帶(圖3-A)，利用在線軟件對(duì)重組表達(dá)載體mRNA翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)與整體密碼子分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其翻譯起始區(qū)存在著穩(wěn)定、復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(△G=-46.89 kJ/mol)(圖3-B)，且AUG起始密碼子后有連續(xù)的稀有密碼子出現(xiàn)，導(dǎo)致FtCHS在E.coliBL21(DE3)中未表達(dá)。因此，經(jīng)序列分析，截去蛋白質(zhì)起始端83個(gè)氨基酸，截短蛋白中保留核心功能域，重新構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TrCHS的E.coliBL21(DE3)表達(dá)菌，誘導(dǎo)表達(dá)呈現(xiàn)明顯條帶，其大小與理論上的TrCHS分子質(zhì)量約34.71 ku相符(圖3-C)，表明重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。可溶性分析顯示，表達(dá)蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體形式存在。

2.4 TrCHS的純化與抗體制備

對(duì)純化后的TrCHS進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明(圖4)，鈷離子層析柱實(shí)現(xiàn)TrCHS的高效純化。為徹底除去可能存在的微量雜蛋白，凝膠染色后切取目標(biāo)蛋白條帶，用于制備抗體。通過(guò)Western blotting分析抗體的特異性，結(jié)果如圖5所示，原核表達(dá)的目標(biāo)蛋白、苦蕎未成熟種子和葉子的總蛋白都與抗血清雜交，顯示單一條帶，說(shuō)明該抗體具有較高的特異性以及該基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)在苦蕎不同組織中也具有特異性。苦蕎葉子和種子的條帶略大于原核表達(dá)的TrCHS蛋白分子電泳條帶，符合預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果，表明苦蕎CHS特異性抗體制備成功。

2.5 組織表達(dá)分析

利用半定量RT-PCR方法對(duì)苦蕎不同組織FtCHS基因轉(zhuǎn)錄情況分析，以基因FtGAPDH為對(duì)照，結(jié)果表明(圖6)，苦蕎FtCHS基因在各組織中均有表達(dá)，其中葉子和種子中表達(dá)量明顯高于花和莖。利用制備的抗體進(jìn)行Western blotting分析苦蕎不同組織中FtCHS的表達(dá)情況，結(jié)果表明(圖7)，F(xiàn)tCHS在各個(gè)組織中均有明顯表達(dá)，其中葉子、種子和花的表達(dá)量極顯著高于莖，而在葉子中的表達(dá)量明顯最高。

3 討論與結(jié)論

植物黃酮代謝路徑中CHS基因?yàn)槎嗷蚣易澹瑢儆冖笮途弁铣擅竅22]。其基因在進(jìn)化過(guò)程中比較保守，但也發(fā)生了不同程度的重復(fù)和分化，導(dǎo)致不同植物基因組中出現(xiàn)數(shù)目和差異較大的拷貝數(shù)[23]，但蛋白質(zhì)序列在不同植物中有較高的同源性，在氨基酸殘基、活性中心、反應(yīng)機(jī)制和酶學(xué)性質(zhì)上有著較高的相似性，但也存在功能上的差異性和多樣性[24]。FtCHS的氨基酸序列中底物結(jié)合口袋位點(diǎn)和環(huán)化反應(yīng)口袋位點(diǎn)，可能起著篩選底物分子的作用及控制代謝流的方向，從而合成各種黃酮類化合物[25]。因此，探討苦蕎次生代謝物的累積與FtCHS的關(guān)系，研究該基因在苦蕎各器官中的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平具有重要意義。本研究首先克隆FtCHS基因及生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)FtCHS功能結(jié)構(gòu)域有序排列分布，同源建模與擬南芥查爾酮合成酶的模型相似度極高，并以同源二聚體形式存在，為該酶結(jié)構(gòu)與功能研究分析提供參考價(jià)值。

利用基因重組技術(shù)獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)則成為基因與蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)手段，可解決因目的蛋白天然提取量不足而導(dǎo)致研究受阻等問(wèn)題，并且滿足目的基因在體外系統(tǒng)中穩(wěn)定擴(kuò)增和表達(dá)[26-27]。其中，外源基因在大腸桿菌中有效且大量表達(dá)是研究中的關(guān)鍵問(wèn)題，影響外源基因表達(dá)的重要因素之一是翻譯起始效率，大腸桿菌中mRNA翻譯起始區(qū)(TIR)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性直接影響核糖體的翻譯[28-29]。本研究通過(guò)重組載體pET-28a(+)-FtCHS轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)未出現(xiàn)明顯表達(dá)條帶，經(jīng)mRNA翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)與密碼子分析，結(jié)果表明該翻譯起始區(qū)存在著穩(wěn)定、復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(△G=-46.89 kJ/mol)，且AUG起始密碼子后有連續(xù)的稀有密碼子出現(xiàn)導(dǎo)致FtCHS在E.coliBL21(DE3)中未表達(dá)。為了解決蛋白表達(dá)問(wèn)題，本研究通過(guò)序列分析截去蛋白質(zhì)起始端83個(gè)氨基酸，保留所有核心功能域，以此來(lái)降低pET-28a(+)-FtCHS的TIR二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能，再構(gòu)建pET-28a(+)-TrCHS的原核表達(dá)工程菌，成功純化目標(biāo)蛋白。本研究再通過(guò)高純度目的蛋白免疫大白兔，成功制備出苦蕎查爾酮合成酶的抗體，并采用制備的抗體，首次在蛋白質(zhì)水平上對(duì)查爾酮合成酶在苦蕎不同組織器官的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。特異性抗體的制備為苦蕎育種過(guò)程中黃酮類化合物在器官中合成、積累與監(jiān)測(cè)等提供了有用的工具。

查爾酮合成酶是在植物次生代謝產(chǎn)物黃酮類物質(zhì)合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，它在植物中表達(dá)量的改變，能夠影響黃酮類物質(zhì)的代謝速率，比如調(diào)控花青素的空間表達(dá)及累積水平，直接影響花色[30]。目前，該酶在少數(shù)模式植物中研究的比較深入，而在其他植物中也獲得了大量的基因信息，但未能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)其進(jìn)行深入的研究，更不能大規(guī)模應(yīng)用于花色改良和育種方向。本研究通過(guò)半定量RT-PCR方法對(duì)苦蕎不同組織中FtCHS基因轉(zhuǎn)錄情況分析，發(fā)現(xiàn)苦蕎FtCHS基因在各組織中均有表達(dá)，其中在葉子和種子中表達(dá)量明顯高于花和莖。通過(guò)Western blotting方法對(duì)苦蕎不同組織中FtCHS的表達(dá)情況分析，發(fā)現(xiàn)FtCHS在各個(gè)組織中均有明顯表達(dá)，其中在葉子、種子和花中的表達(dá)量極顯著高于莖，而FtCHS在葉子中的表達(dá)量明顯最高，推測(cè)苦蕎葉子和種子中高含量的黃酮類物質(zhì)與FtCHS基因有直接關(guān)系[25,31]。外界因素對(duì)苦蕎查爾酮合成酶基因表達(dá)也具有調(diào)控作用，推測(cè)FtCHS基因可能參與抵御苦蕎逆境脅迫[32]，后續(xù)研究擬通過(guò)FtCHS功能鑒定研究其在苦蕎分子育種改良中的作用。本研究闡述了查爾酮合成酶的基因克隆與組織表達(dá)分析，旨在為進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)查爾酮合成酶基因功能的發(fā)掘與利用，為苦蕎特色基因資源開(kāi)發(fā)研究提供理論依據(jù)和思考 方向。