番紅花花蕊分化期差異蛋白表達的鑒定與分析

張衡鋒，張煥朝

(1.江蘇農牧科技職業學院 園林園藝學院，江蘇泰州 225300；2.南京林業大學 林學院，南京 210037)

花蕊分化是植物開花和花芽分化的核心階段，是一個復雜的生理生化和形態建成過程。蛋白質組學通過尋找和篩選任何有意義因素引起的不同樣本之間的差異蛋白質譜，用以揭示細胞生理的進程與本質，并對某些關鍵蛋白的定性和功能進行分析。近年來，蛋白質譜技術在植物開花和花芽分化方面的研究已取得了豐碩成果[1-4]。番紅花(CrocussativusL.)屬鳶尾科番紅花屬多年生三倍體鱗莖類球根花卉，原產于伊朗、小亞細亞半島和希臘等地，中國各地常見引種栽培[5]。番紅花以花柱入藥，稱西紅花，具有活血、化瘀、生新、通經等功效，作為傳統名貴中藥收入《中華人民共和國藥典(2020)》。番紅花生境苛刻，產量極低(約8 kg/hm2)，致使價格昂貴(約10 $/g)，素有“植物黃金”之稱[6]，由于其三倍體特性，難以進行有性繁殖，致使繁殖系數低、種球退化、病蟲害頻發，已成為制約中國番紅花產業發展的關鍵因素。為有效解決番紅花生產技術瓶頸，除傳統栽培技術研究外，王莉等[7]和陳書安等[8]學者創新開展了番紅花胚性愈傷組織調控和花柱-柱頭狀物誘導研究[7-9]，提高了番紅花胚性愈傷組織和花柱-柱頭狀物的分化頻率，但未能真正構建起花柱定向離體培養體系，缺乏花柱分化分子機理理論支持。針對番紅花開花這個核心環節，張衡鋒等[10]、周琳等[11]、Qian等[12]學者對其花芽結構和開花調控因子等進行了研究，這些研究為番紅花生產提供了理論支持，但針對番紅花開花分子機理尤其是花蕊分化機理的研究較少。

本研究聚焦番紅花藥用器官花蕊的分化過程，應用MALDI/TOF/TOF-MS/MS質譜鑒定與分析技術，比較分析花蕊分花期蛋白質組的變化，確定與分化過程密切相關的關鍵蛋白，分析其可能的功能后構建番紅花花蕊分化的分子調控模型，旨在揭示番紅花花蕊分化的分子機理，為番紅花定向培養和標準化生產提供理論基礎和科學 依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗所用番紅花(CrocussativusL.)生長于江蘇中藥科技園(32°27′42″N, 119°55′57″E)，屬于亞熱帶季風性氣候，年降水量1 020.5 mm，全年最高、最低和平均溫度分別為38.2 ℃，-7.2 ℃和14.9 ℃，全年光照1 746 h，土壤類型為高沙土，正常水肥管理。

1.2 試驗材料

2020年5月10日收獲仔球并儲藏于陰涼通風處，2020年7月5日(番紅花球莖處于休眠狀態)挑選生長完好，質量(25±1)g的種球300個，置于溫度(25±0.5)℃，空氣濕度75%的智能培養箱中培養，全程暗培養。自放入智能培養箱中開始，每3 d用電子顯微鏡觀察番紅花球莖花芽，以花序分化出第一朵小花為準，在花被原基分花期(TD)、雄蕊原基分花期(SD)和雌蕊原基分花期(PD)(圖1)，每10個番紅花莖尖為1次生物學重復，重復3次。所有莖尖樣品取樣后立即用錫箔紙包裹并放入液氮速凍20 min，速凍后在-80 ℃條件下保存，備用。

1.3 蛋白提取

采用TCA/丙酮沉淀法[13]提取番紅花樣品蛋白，略作修改。1 000 mg樣品(鮮質量)研磨成粉，在-20 ℃條件下用含有100 g/L三氯乙酸(TCA)、0.7 g/L DTT和1 mmol/L PMSF的丙酮溶液(-20 ℃預冷)懸浮萃取2 h。在4 ℃條件下15 000 r/min離心20 min，棄上清，再用預冷丙酮溶液漂洗萃取3次，室溫下放置1 h，待丙酮揮發完全后，將沉淀物冷凍干燥后-80 ℃條件下保存。

1.4 蛋白質含量測定

采用Bradford法[14]進行番紅花花芽樣品蛋白含量的測定，略作修改。以100 mL 95%乙醇、200 mL 85%磷酸和500 mg考馬斯亮藍G-250制成Bradford儲備液。由425 mL雙蒸水、15 mL 95%乙醇、30 mL 85%磷酸和30 mL Bradford儲備液制成工作液，雙層濾紙過濾后，4 ℃棕色瓶保存。以1 mg/mL的BSA溶液為標準液，吸取100 μL的樣品液和標準液加入到5 mL的Eppendorf管中，加入3 mL Bradford儲備液混合搖勻，2 min后在分光光度計595 nm處測定吸光值，建立標準曲線，并根據標準曲線測定樣品蛋白質含量。

1.5 雙向電泳(2-DE)、凝膠染色和圖譜分析

取1.0 mg的樣品蛋白粉末，加入適量的IEF裂解液[7 mol/L urea+2 mol/L Thiourea+ 40 g/L CHAPS+0.5%(V/V)IPG buffer(24 cm linear, pH 4～7)]溶解，注入每一條IPG膠條(24 cm，pH 4～7)上。第一向固相pH梯度聚焦電泳：采用Ettan IPG-phor系統(Bio-Rad，美國)，電泳條件為20 ℃，50 μV/trip，200 V電流1 h，500 V電流1 h，1 000 V電流1 h，8 000 V電流4 h，8 000 V電流6 h。聚焦結束后，膠條進行2次平衡。第二向SDS-PAGE垂直板電泳：平衡好的膠條配置成12%的聚丙烯酰氨凝膠，灌入玻板后加飽和正丁醇封膠，凝膠完全聚合后置于SDS-PAGE膠面上，加入蛋白分子量Marker，并用 0.5%的低熔點瓊脂糖封膠。待低熔點瓊脂糖凝固后將玻板置于Ettan IPG-phor系統(Bio-Rad，美國)中開始電泳，1 W/膠條先電泳1 h，之后5W/膠條繼續電泳，至溴酚藍跑至離膠底1.0 cm時停止電泳。

電泳結束后用考馬斯亮藍G-250染色6 h，之后超純水清洗至凝膠背景無色透明，蛋白點清晰為止。

所有染色的電泳凝膠用300 dpi的Image Scanner Ⅲ(GE Healthcare Life Sciences，瑞典)掃描成像，并用PDQuest 7.2軟件進行圖譜分析，只有蛋白點差異表達超過1.5倍和P<0.05(LSD)的變化被認定為差異表達點。所有待測樣品雙向電泳分析和凝膠圖譜分析重復3次。

1.6 蛋白質膠內酶解、鑒定和數據庫查詢

參照Kumarathasan等[15]方法進行蛋白質膠內酶解，略作調整。從凝膠上切1～2 mm的蛋白點凝膠放入Eppendorf管中，加入100 μL的100 mmol/L的NH4HCO3和100 μL的50%的ACN進行脫色，凍干后加入10 μL的 12.5 ng/μL胰蛋白酶溶液酶解12 h，加入20 μL的100 mmol/L的NH4HCO3和20 μL的50% ACN和0.1% TFA，取上清液，凍干，在干燥的樣品中加入10 μL的0.1%的TFA和10 μL的C18Zip脫鹽，用以質譜鑒定。

采用4800串聯飛行時間質譜儀(Applied Biosystems，美國)進行質譜分析，采用正離子反射模式和自動獲取數據的模式進行數據采集，PMF質量掃描范圍700～3 500 ku，使用解釋模式自動排除胰蛋白酶自解峰、常見的角蛋白污染峰，選擇強度最大的5個峰作為母離子進行串聯質譜分析。

所有肽植物圖譜通過MASCOT檢索引擎(http://www.matrixscience.com)在植物的NCBInr數據庫中進行檢索。最大允許漏切位點為1，質量誤差范圍設置為PMF100×10-6，MS/MS為0.2 ku。

2 結果與分析

2.1 2-DE蛋白圖譜和差異蛋白

從2-DE圖譜中蛋白點分布來看(圖2)，蛋白點的等位點主要分布于4.0～7.0，分子質量主要集中在18.5～117.0 ku，每塊膠條上有超過900個蛋白點重復表現，匹配率約79%～81%。所有蛋白點中，8個點在花被原基分化期特異表達，5個點在雄蕊原基分化期特異表達，2個點在雌蕊原基分化期特異表達。相鄰兩個時期中，各蛋白點表現出特異、升高、下降和持平4種變化(圖3)，共有81個蛋白點呈現出顯著差異(表達豐度值vol%>1.5倍，P<0.05)。

2.2 差異表達蛋白的鑒定和分類

探索番紅花花芽分化過程中差異蛋白的功能對探索番紅花開花機理具有重要意義。根據蛋白質差異分析結果，番紅花花芽分化不同時期的81個差異表達點經質譜分析及NCBInr數據庫檢索，75個差異蛋白得以鑒定，并對其功能進行分類(表1)，可靠鑒定率達84.27%，功能類別包括：代謝(25個，33.33%)，能量(7個，9.33%)，細胞防御(8個，10.67%)，蛋白命運(20個，26.66%)，細胞合成原件(5個，6.67%)，結合蛋白和輔助因子(3個，4.00%)，細胞周期和DNA加工(2個，2.67%)，細胞運輸(5個，6.67%)。

2.3 蛋白差異表達分析

2.3.1 糖和能量代謝相關蛋白 由表1和圖4可知，在差異表達的蛋白中代謝類占比最大，其中25個為調控糖代謝和能量代謝的關鍵蛋白，說明在番紅花花蕊分化過程中，糖和能量代謝是最主要的生理反應之一。番紅花花蕊分化期，功能葉尚未形成，因此此間糖代謝途徑應主要是糖酵解和糖異生過程。在花蕊分化期內，顆粒結合淀粉合成酶(GBSS)活性持續下降，GBSS是唯一可以對直鏈淀粉生物合成起作用的關鍵酶[16]，說明在此期間直鏈淀粉的合成能力在減弱。參與糖酵解代謝的關鍵酶FBA、UGPase、ATPase和UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷轉移酶活性呈現下降趨勢，而FRK、TPI、NSE和LOS2活性呈現上升趨勢，說明在眾多糖代謝路徑中，蔗糖經F1P產生丙酮酸途徑應是番紅花花蕊分化糖酵解的主要途徑。乙酰-CoA羧化酶活性降低，說明乙酰輔酶A作為TCA循環底物的能力也在增強。

2.3.2 氨基酸代謝和植物信號調控相關蛋白 甲硫氨酸tRNA連接酶參與甲硫氨酸到甲硫氨酸tRNA的耦合過程，使mRNA的遺傳信息準確無誤地反映到甲硫氨酸序列上。由表1和圖4可知，番紅花花蕊分化過程中，甲硫氨酸tRNA連接酶活性的持續減弱，說明甲硫氨酸水平在降低。在精氨酸酶等酶的催化作用下，精氨酸可水解成鳥氨酸和其他含氮化合物，這些代謝物質均是蛋白質合成的重要底物，隨著精氨酸酶活性的持續增強，鳥氨酸和含氮化合物水平也將隨之升高。半胱氨酸是植物體內保護細胞環境不受氧化應激影響的一種氨基酸，其殘基之間S-S的形成也是分子伴侶活化的關鍵性步驟，是一些蛋白正確折疊和穩定結構的必需物，半胱氨酸合成酶活性的增強，可維持花芽細胞不受氧化應激影響，并增加分子伴侶活性，促進花蕊細胞的分化。黃堿酮3-羥化酶可調控黃酮與花青素產物的合成，黃堿酮3-羥化酶在番紅花雄蕊分化期迅速升高利于黃酮合成，進而促進雄性配子體和花粉管發育信號的傳遞[17]。

2.3.3 活性氧代謝相關蛋白 植物胞質中主要的活性氧代謝系統為抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環，其中抗壞血酸過氧化氫酶(APX)是關鍵酶之一。鳥苷二磷酸甘露糖在甘露糖-3′,5′-異構酶(GME)的催化作用下可轉變為L-甘露糖-半乳糖，其是抗壞血酸合成酶的重要底物。在細胞質內乳酰谷胱甘肽裂解酶通過一個1,2-氫轉移，催化丙酮醛轉化為乳酸谷胱甘肽，進而水化產生谷胱甘肽和D-乳酸鹽，實現解毒作用[18]。如表1和圖4所示，APX、CAT、TpxⅡ和GME活性增強，說明番紅花花蕊分化過程中，花蕊細胞內出現活性氧(ROS)積累，通過活性氧代謝，將H2O2等ROS維持在一個較低水平。

2.3.4 蛋白修飾和加工相關蛋白 熱激蛋白是生物受到高溫或其他環境脅迫誘導產生的一種熱激反應，根據分子質量大小，可分為小分子熱激蛋白(分子質量小于50 ku)和大分子熱激蛋白(分子質量大于50 ku)，泛素蛋白就是一種通過ATP促進細胞蛋白質水解的小分子量熱激蛋白，而葉綠體HSP60和葉綠體HSP70屬于誘導型大分子熱激蛋白，葉綠體HSP60具有參與核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶全酶的裝配和監護葉綠體內蛋白的折疊、組裝的雙重功能[19]。HSP70通常在植物體內表達量較少，但在應激原的作用下表達迅速增加，其兼具ATP酶活性和分子伴侶功能[20]。如表1和圖4所示，在番紅花花蕊分花期內，熱激蛋白、泛素蛋白表達量先下降后上升，說明在番紅花分化過程中，伴隨著大量熱激反應，保障蛋白修飾和加工順利進行。

2.3.5 細胞結構建成相關蛋白 細胞骨架是真核細胞的重要組成部分，包括微絲、微管和中間絲，其中微絲的基本組成單位就是肌動蛋白。肌動蛋白在細胞分裂和細胞膨脹等形態建成與功能方面具有關鍵的作用[21]。微管蛋白與細胞壁微原纖維呈橫向分布，限制細胞的橫向膨脹，促進細胞縱向延長。如表1和圖4所示，番紅花花蕊分化過程中，肌動蛋白表達量先上升后下降，β-肌動蛋白和微管蛋白表達量持續升高，說明番紅花雌蕊分化期參與的肌動蛋白主要是β-肌動蛋白。隨著分化的推進，需要大量的β-肌動蛋白和微管蛋白參與細胞骨架結構的構建。當植物受到外界環境壓力或接收到植物發育內在信號時，植物延伸因子(eEF1)會迅速做出反應，通過在核糖體上催化氨基酸鏈的延伸而推動、控制蛋白質的合成，其不僅可以將GTP和氨基酸tRNA運至核糖體上。在番紅花花蕊分化過程中，eEF1A的對應物延伸因子Tu(EF-Tu)表達量上升，說明番紅花花芽分化與eEF1A主導的蛋白質合成代謝密切相關。3-oxo-γ(4,5)-類固醇-5-β-還原酶可促進葡萄糖-1-磷酸向纖維素的轉變，其表達水平的提高有利于細胞纖維結構的建成。

3 討論與結論

3.1 代謝和信號調控過程

蔗糖和淀粉是高等植物碳水化合物貯藏的主要形式，也是協調植物庫源關系的重要信號分子。前期研究表明，番紅花花芽分化過程中，可溶性糖含量與淀粉含量顯著負相關，在雄蕊分化階段和雌蕊分化階段，莖尖中始終維持高水平可溶性糖[22]。因此，糖酵解應是番紅花花蕊分化中糖代謝和能量代謝的主要形式，以此為花蕊分化提供足夠的能量。根據蛋白差異表達分析，其代謝路徑可能為：蔗糖經蔗糖酶的催化分解成果糖、葡萄糖等己糖，果糖經果糖激酶(FRK)的催化可形成果糖-1-磷酸(F1P)，F1P經醛縮酶催化，形成甘油醛和磷酸二羥丙酮(DHAP)，甘油醛經甘油醛激酶的作用，最終形成3-磷酸甘油醛(G3P)，而DHAP在磷酸丙糖異構酶(TPI)的催化作用下也形成G3P，最終一分子果糖形成了兩分子G3P。G3P經過氧化和磷酸化反應形成2-磷酸甘油酸(G2P)，G2P經糖分解烯醇酶(NSE)和烯醇酶(LOS2，enoslase)的催化和分子重排生成丙酮酸，丙酮酸經過氧化脫羧最終生成乙酰基輔酶A(Ac-CoA)，進入TCA循環，而蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酰輔酶A連接酶正是TAC循環中的關鍵酶[23](圖4)。

植物花芽分化伴隨著大量的氨基酸代謝和植物信號調控。甲硫氨酸兼有乙烯合成前體和DNA甲基化修飾兩方面的作用，而且一些DNA甲基化修飾可抑制成花基因FLC的表達[24]。甲硫氨酸水平的降低可能會導致乙烯含量和DNA甲基化修飾水平的降低，因乙烯與細胞分裂素存在拮抗作用，由此促進細胞分裂素相對水平升高和FLC的表達，這與前期研究番紅花花芽分化中，莖尖中維持高水平內源CTK[22]的研究結果基本一致。鳥氨酸是多胺(PA)等重要信使分子的前體[25]，PA對于花基啟動、信使RNA轉錄和特異蛋白翻譯具有重要作用[26]，前期關于番紅花花芽分化的研究中，RNA、蛋白質含量均先升高后降低，核酸與可溶性蛋白含量顯著或極顯著相關[10]，所以鳥氨酸水平升高極有可能促使PA等代謝產物大量產生，進而促進花蕊分化。

植物受到脅迫、缺乏營養、發育成熟過程中均會導致活性氧(ROS)的積累，低水平的ROS具有乙烯等植物激素信號傳遞作用，調控植物生長發育[27]，高水平ROS則會誘導植物產生應激反應，形成抗氧化防御機制。番紅花花蕊分化過程中，可能因為分化過程中需要大量營養供給，從而誘發活性氧積累，APX和CAT等抗氧化酶清除過多的ROS，將ROS維持在較低水平，進而降低乙烯等植物激素水平，促進細胞分裂和生長發育，通過調控植物激素信號來推進番紅花花蕊的分化進程。另外，番紅花花蕊分化期處于夏季，細胞可能通過抗氧化防御機制清除高溫誘發的ROS積累，獲得合適的發育環境。

3.2 熱激反應和細胞結構建成過程

泰州地處北亞熱帶濕潤氣候區，夏季高溫多雨，氣溫最高在7月。番紅花花蕊分化期一般從7月下旬至8月上旬，而其適合溫度區間為 23 ℃～27 ℃。較高的溫度會誘導熱激蛋白積累，而雄蕊原基分化期熱激蛋白下降可能與花粉管分化有關，與雌性組織不同，花粉管萌發過程中缺乏熱激蛋白mRNA的積累，導致合成熱激蛋白的能力逐漸喪失[28]，進入雌蕊原基分花期后由于熱激反應，熱激蛋白水平又迅速上升。

在番紅花雄蕊原基分化期，莖尖分生組織繼續分化花被片細胞，需要大量的微管細胞的參與。在雄蕊原基分化期，許多莖尖已經開始分化出第二小花，這可能是β-肌動蛋白持續增加的原因之一。另外，延伸因子Tu(EF-Tu)表達量與微管蛋白及磷脂酰肌醇激酶活性同步上升，可能是因為EF-Tu通過結合微管蛋白來調節細胞骨架結構和活化磷脂酰肌醇激酶[29]，具體作用機理需要進一步深入研究。

3.3 其他植物花芽分化的比較

Zhang等[2]運用轉錄組學和蛋白質組學方法研究百子蓮(Agapanthuspraecoxssp.orientalis)開花發現：在百子蓮花芽分化和開花過程中，得以可靠鑒定的蛋白主要涉及能量代謝、信號轉導、蛋白命運和細胞構成；You等[3]在研究龍眼(DimocarpuslonganLour.)開花逆轉過程中發現：能量代謝和活性氧代謝相關蛋白可能在花芽分化過程中發揮主要作用，這些蛋白主要包括葡糖糖-6-磷酸異構酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶連接酶、蘋果酸脫氫酶、ATP酶，過氧化氫酶和微管蛋白等；陳一帆等[4]在研究黃連木花芽分化期差異蛋白發現：雄蕊與雌蕊分化與活性氧代謝、核糖體活動、光合作用等相關蛋白密切相關。以上研究均表明，其他植物成花過程中，絕大部分差異蛋白種類與番紅花花蕊分化差異蛋白種類基本相似，只是部分蛋白在相同或相近分化期表現出不同變化趨勢，這可能與植物品種以及培養環境有關。本研究通過蛋白質組學篩選和研究番紅花花蕊分花期差異蛋白變化，獲得了大量與番紅花花蕊分化相關的新信息。本研究鑒定了75個可能在番紅花花蕊分化中發揮重要作用的蛋白，這些蛋白可能參與了糖酵解、信號傳導、氨基酸代謝、活性氧代謝、蛋白修飾和加工、細胞結構建成等生理作用，并據此初步構建了番紅花花蕊分化的分子調控模型，為進一步揭示番紅花花蕊分化調控機制提供了新依據，為番紅花定向培養提供新線索。