一種快速鑒定羚牛組織的技術研究

李一丹,郭 睿,馬 征,鄭 燕,昝林森,2,李安寧

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.陜西省林業科學院，西安 710082)

羚牛(Budorcastaxicolor)別名扭角羚，屬于偶蹄目、牛科[1]，是國家一級重點保護野生動物，并被世界自然保護聯盟(The World Conservation Union,IUCN)列為易危物種[2]。秦嶺羚牛(Budorcastaxicolorbedfordi)，又叫金毛羚牛，是4個羚牛亞種中體型最大、毛色最靚麗的。據統計，秦嶺羚牛的種群數量已不足6 000頭[3]，究其原因：一方面是由于其生境被破壞，棲息地面積減少；另一方面則是由于非法盜獵行為的發生。

雖然目前中國加大了對非法盜獵的打擊力度，但在金錢利益的誘惑下，羚牛非法盜獵行為仍時有發生[4]。目前，羚牛鑒定方法主要采用肉眼觀察法和形態鑒定法，但對于已切割成塊或食用的情形，僅靠肉眼或形態觀察的方法顯然不適用。但現存鑒定技術的操作步驟較為繁瑣，因此實際應用過程中存在很多不便，且無法進行準確鑒定[5-6]。另一種有關基因條形碼法來鑒定肉品真偽和種屬來源的研究也有報道，基于DNA 條形碼技術，可以成功對三文魚的真偽進行鑒別，并對產地進行溯源[7]。隨著分子生物學技術的不斷發展，馮慧等[8]通過建立羚牛、林麝、斑羚等15種獸類線粒體細胞色素b基因(Cytochrome b,Cytb)的基因條形碼，構建系統進化樹對待測樣品進行分析，從而確定其與已知15種獸類的親緣關系，但該方法同樣存在鑒定準確性不高的問題[8]。因此，有必要開發一種能夠用于快速準確鑒定羚牛組織的分子生物學方法。實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)，具有高靈敏性、高特異性、高精確性的特點，目前已廣泛應用于肉類摻假的鑒定[9-12]。本研究擬采用qPCR技術，篩選特異性引物，為快速準確地鑒定羚牛組織提供有效的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

秦嶺羚牛肌肉組織樣本采集于陜西珍稀野生動物搶救飼養研究中心；秦川牛的肌肉組織采集于西北農林科技大學國家肉牛改良中心；雞肌肉組織采集于成年黃羽雞；綿羊、山羊、豬的肌肉組織分別由西北農林科技大學動物科技學院楊雨鑫副教授、王平副教授、安小鵬副教授和李曉副教授饋贈。

1.2 基因組DNA的提取

將肌肉組織用組織破碎儀處理為細胞懸液，離心后去除上清，依次加入緩沖液GA，Proteinase K，緩沖液GB，無水乙醇，緩沖液GD，漂洗液PW，洗脫緩沖液TE。詳細步驟參見試劑盒說明書(DP304，TIANamp Genomic DNA Kit)。DNA濃度用多功能酶標儀(Infinite M200PRO,TECAN)進行測定。

1.3 RNA的提取與cDNA反轉錄

肌肉組織采用研磨法研碎后，采用Trizol法提取總RNA(TaKaRa)，將組織樣品稱量后倒入盛有液氮的研缽中，研磨組織至粉末狀，加入RNAios plus，充分勻漿，勻漿液靜置5 min后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，勻漿裂解液中添加氯仿(RNAios plus的1/5體積量)，混合至溶液乳化成乳白色，溶液靜置5 min后，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新的離心管中，加入異丙醇(0.5～1倍RNAios plus的體積)后靜置10 min，再次4 ℃，12 000 r/min離心15 min，試管底部會出現RNA沉淀。RNA濃度由多功能酶標儀(Infinite M200PRO,TECAN)進行測定，選取OD260/OD280為1.8～2.2的RNA，按照PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)說明書對mRNA進行反轉錄[13-14]。

1.4 qPCR

表1 引物序列

1.5 統計分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖及顯著性檢驗分析，采用t檢驗，以羚牛為對照。“**”表示P<0.01。

2 結果與分析

2.1 熒光定量PCR引物的設計與鑒定

根據前期羚牛肌肉轉錄組的測序結果(SRA數據庫提交號:PRJNA720167)[17]，篩選出5條與牛、羊、豬和雞等物種保守性較低的轉錄本序列為模板，設計5對引物(表2)。以羚牛肌肉cDNA為模板，通過qPCR檢測5對引物的熔解峰，結果顯示引物tk-p1(TM=80.0 ℃)，tk-p3(TM=84.5 ℃)和tk-p5(TM=80.5 ℃)只有單一的熔解峰，而tk-p2(TM=77.5 ℃/84.5 ℃)和tk-p4(TM=79.5 ℃/89.0 ℃)的熔解峰為雙峰(圖1)，這表明引物tk-p1、tk-p3和tk-p5特異性較高，可用于后續試驗。

表2 參考序列信息

2.2 mRNA水平驗證引物的特異性

分別以tk-p1、tk-p3和tk-p5為引物，以秦川牛、綿羊、山羊、豬、雞和羚牛的肌肉cDNA為模板，進行qPCR擴增，結果顯示引物tk-p1的表達量在山羊中最高，羚牛中次之，這表明引物tk-p1無法用于鑒定羚牛與山羊的肌肉組織；而引物tk-p3和tk-p5的表達量在羚牛中最高，且顯著高于其在其他幾個物種中的表達(圖2)，這表明引物tk-p3和tk-p5可用于在mRNA水平區分羚牛與山羊等物種的肌肉組織。

由于肌肉組織RNA在常溫下很容易發生降解，實際鑒定過程中從mRNA水平進行鑒定存在一定的技術局限性。如果能用基因組DNA為模板進行鑒定，將極大地提高其實用性。

2.3 基因組DNA水平驗證引物的有效性

為了驗證以基因組DNA為模板進行qPCR鑒定的可行性，分別利用tk-p3和tk-p5引物，以秦川牛、綿羊、山羊、豬、雞和羚牛的基因組DNA為模板進行qPCR擴增，結果顯示引物tk-p3和tk-p5在羚牛中的表達量顯著高于山羊、綿羊、秦川牛、豬和雞(圖3)。這與其在mRNA水平的表達趨勢一致，表明引物tk-p3和tk-p5可在基因組DNA水平區分羚牛與山羊等物種。

3 討 論

由于羚牛多數時間性情較為溫順，對其他動物不會主動發起攻擊[18]，因此容易被不法分子誘捕偷獵。在采用肉眼觀察法和形態鑒定法對非法盜獵取證時，如果羚牛個體形態保存較為完整，則鑒定相對較為容易；但如果羚牛個體已被分割或食用時，則鑒定就非常困難[5-6]。此時，就需要引入分子生物學的鑒定方法，目前主要包括聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)法、限制性片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)法、基因條形碼法、qPCR法等。

采用基于Cytb基因的通用引物進行PCR擴增，結合擴增產物測序的方法，能夠成功地鑒定出市場上摻假的肉制品[19]，但其準確性并不高。基于RFLP法，可以快速準確地鑒定出鹿茸的真偽[20]，也可用于區分牛肉、羊肉和豬肉的真偽[21]，還可以用于鱈魚成分的鑒定[22]，但該方法存在一定的局限性，與羚牛親緣關系較近的綿羊和山羊等未包含在Cytb基因條形碼數據庫中，因此其鑒定結果的準確性也有待驗證。

近年來，越來越多的研究采用qPCR法對種屬來源進行鑒別。設計特異性qPCR引物，能成功將3種鱈科鱈魚進行真偽鑒定，也可快速鑒定出牛、羊肉真假并且可以對其中的牛、羊肉成分含量進行量化分析[10-11]，以豬的雌激素受體基因為模板，設計一對特異性引物，基于qPCR法快速準確定量檢測豬肉制品中的豬肉含量[23]。但由于羚牛與牛、羊的親緣關系很近，采用Cytb基因或雌激素受體基因無法將其準確區分開。因此，選擇在秦嶺羚牛與牛、羊等物種中本研究考慮保守性較差的基因序列為模板，設計qPCR引物，對羚牛肌肉組織進行鑒定。

截至目前，尚無羚牛參考基因組的報道。本研究根據前期羚牛肌肉的轉錄組數據，通過數據庫比對篩選到5條與牛、羊等物種保守性較低的轉錄本，然后以這5條轉錄本為模板，設計并篩選出特異性的定量引物。采用qPCR法從mRNA水平篩選出能將羚牛肌肉組織與牛、羊等肌肉組織進行快速有效區分的兩對定量引物。但在實際鑒定過程中，羚牛肌肉組織可能在室溫放置較長時間，RNA會發生降解。因此，進一步采用羚牛基因組DNA為模板，進行qPCR分析發現這兩對定量引物同樣適用。這一方面豐富了利用qPCR法對種屬進行鑒定時模板基因的選擇方法，另一方面也為羚牛組織真偽的鑒定提供了強有力的技術支撐。

4 結 論

本研究篩選出兩對有效qPCR引物tk-p3和tk-p5，可用于羚牛組織的真偽鑒定，為羚牛防盜獵提供了一種快速準確鑒定的分子生物學方法。

致謝：感謝陜西省林科院雷穎虎副院長和陜西珍稀野生動物搶救飼養研究中心賈康勝主任在羚牛采樣過程中給予的幫助。感謝西北農林科技大學動物科技學院楊雨鑫副教授、李曉副教授、王平副教授、安小鵬副教授無私提供試驗樣品。