影響慢性乙型肝炎功能性治愈的因素及其機制

郭藝飛， 張繼明,2

1 復旦大學附屬華山醫院 感染科， 上海市傳染病與生物安全應急響應重點實驗室， 國家傳染病學中心，上海 200040； 2 上海市重大傳染病和生物安全研究院， 上海 200032

慢性乙型肝炎(CHB)功能性治愈被定義為表面抗原(HBsAg)陰轉伴或不伴表面抗體(抗-HBs)的出現，為CHB治療的理想終點[1]。已有研究[2-3]顯示HBsAg陰轉與肝硬化甚至肝癌風險的降低密切相關。但是自發HBsAg的陰轉發生概率極低，每年的HBsAg陰轉率約為1%[4]。即使目前核苷(酸)類似物(NUC)與聚乙二醇干擾素α(PEG-IFNα)可以提高功能性治愈率，但由于兩類治療方法存在各自的局限性，因此了解影響CHB功能性治愈的影響因素及其機制對CHB治療具有一定的指導意義。

1 影響功能性治愈的因素

1.1 HBV相關因素 HBsAg為實現功能性治愈的關鍵標志物?；€或停藥時低HBsAg水平、治療早期HBsAg水平的快速下降與較高的HBsAg陰轉率密切相關[5-7]。除此之外，Pfefferkorn等[8]通過對83例經NUC或PEG-IFN治療的CHB患者進行回顧性研究，發現作為HBsAg的組成成分之一的中表面蛋白，在總的HBsAg消失前(12.8±8.7)個月已檢測不到，提示中表面蛋白定量檢測可以預測HBsAg陰轉。

HBeAg在HBV感染的慢性化中起著重要作用[9]，而且HBsAg陰轉一般發生在HBeAg清除之后，提示HBeAg有可能影響HBsAg陰轉[10]。一項關于富馬酸替諾福韋酯治療的研究[11]表明，在A或D基因型的人群中，HBeAg在治療24周下降 ≥2.2 log PEIU/mL與更高的HBsAg陰轉率相關。

血清中高抗-HBc水平可能與肝臟內炎癥活動增強有關[12]。近期一項研究[13]發現，在接受干擾素治療的CHB患者中，基線高抗-HBc水平(HBeAg陽性患者≥4.4 log IU/mL，HBeAg陰性患者≥4.0 log IU/mL)與更好的療效和更高的HBsAg陰轉率相關。

HBcrAg由乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、HBeAg和p22cr三部分組成，可以反映肝內cccDNA水平與轉錄活性[14]。Sonneveld等[6]近期的停藥研究發現HBsAg水平(<100 IU/mL)、低于檢測下限的HBcrAg水平與更高的HBsAg陰轉率相關。

關于自發陰轉的一項大樣本長期隨訪研究[15]表明，不論是基線還是隨訪過程中的HBV DNA水平均與HBsAg陰轉有關。但是，在接受NUC和PEG-IFN治療的患者中，HBV DNA與HBsAg陰轉的相關性還需進一步研究。

HBV基因的分布在不同地區差異很大，歐洲主要以A、D基因型為主，東亞和東南亞地區主要以B、C基因型為主[16]。HBV感染的自然史研究及近期的停藥研究[6,17]表明在亞洲人種中，C基因型患者發生HBsAg陰轉的概率較B基因型患者高。在長期進行富馬酸替諾福韋治療的HBeAg陰性患者中HBsAg陰轉多見于A和D基因型[18]。一項接受干擾素ɑ治療的HBeAg陽性患者的長期隨訪研究[19]顯示，47%的A基因型患者和44%的B基因型患者在隨訪78周過程中發生HBsAg陰轉，只有28%的C基因型患者和25%的D基因型患者發生HBsAg清除。

1.2 宿主相關因素 研究[20]表明自發HBsAg清除與年齡有關，HBsAg陰轉率隨著年齡的增大逐漸升高。關于CHB兒童治療的研究發現，越早治療其HBsAg陰轉率越高。一項關于1～17歲HBeAg陽性患兒長達13年的隨訪研究[21]顯示，11.08%的患兒在PEG-IFN治療72周后實現HBsAg陰轉，在隨訪結束時，46.95%的患兒實現HBsAg陰轉，其中1～7歲的患兒HBsAg的陰轉率可達71.4%。近期關于學齡前兒童的研究[22]同樣表明對于自發出現ALT水平升高且接受抗病毒治療的患兒陰轉率可達25%。

ALT水平升高被視為機體免疫介導清除病毒的表現，被證實與干擾素治療實現的HBsAg陰轉密切相關[5]。對于免疫控制期的患者，PEG-IFN治療早期HBsAg水平的快速下降及12周時ALT的升高是預測HBsAg陰轉的獨立因素。

1.3 治療方案 大量臨床研究[23-24]證明NUC與PEG-IFN的聯合治療是實現HBsAg陰轉最有效的方式。值得注意的是，相較于NUC與PEG-IFN的初始聯合治療，接受過長期NUC治療并獲得病毒學應答的患者加用或換用PEG-IFN治療時HBsAg水平下降幅度更大且HBsAg陰轉率更高[25]。

2 影響功能性治愈的相關機制

2.1 HBV相關因素影響功能性治愈的機制

目前關于HBV慢性感染的機制尚未完全闡明。觀察性研究顯示單獨使用NUC并不能提高CHB的功能性治愈率，而以免疫調節為主要作用的干擾素卻可顯著提高HBsAg陰轉率，提示功能性治愈的實現需要適度激活機體的抗病毒免疫。

2.1.1 HBV相關因素與特異性免疫 在HBV急性感染時，CD8+T淋巴細胞介導的細胞毒效應在HBV清除上發揮主要作用，但是在HBV慢性感染時，HBV特異性T淋巴細胞功能被抑制甚至出現耗竭[26-27]，還有研究[28]表明在HBsAg陰轉的人群中呈現出與未陰轉人群不同的CD4+T、CD8+T淋巴細胞表型，科學家推測恢復HBV特異性T淋巴細胞的功能可能是實現乙型肝炎功能性治愈的途徑之一。Kim等[29]通過比較低HBsAg水平(<500 IU/mL)和高HBsAg水平(>50 000 IU/mL)患者中HBV特異性T淋巴細胞，發現HBV特異性CD4+T淋巴細胞上程序性死亡受體1(PD-1)在低HBsAg水平的患者中表達較低，使用PD-1阻斷劑后可以提高T淋巴細胞的抗病毒免疫。但是也有研究[30-31]顯示，HBsAg水平并不影響HBV特異性T淋巴細胞反應，患者年齡是影響HBV特異性CD4+、CD8+T淋巴細胞功能的關鍵因素。Aliabadi等[30]研究者發現低HBcrAg水平也與HBV特異性CD4+T淋巴細胞反應有關。此外，有研究[27]表明HBeAg狀態也會影響HBV特異性T淋巴細胞，HBeAg陽性患者中針對核心抗原的干擾素γ和IL-10反應都受到抑制。近期一項研究[32]比較了急性HBV感染、慢性HBV感染以及功能性治愈人群中HBV特異性CD4+T淋巴細胞，發現在急性HBV感染的人群中呈現出強烈的HBV特異性記憶CD4+T淋巴細胞反應；慢性HBV感染者中，HBV特異性CD4+T淋巴細胞頻率低且HBV特異性CD4+中央型記憶T淋巴細胞極少；功能性治愈者中，HBV特異性CD4+T淋巴細胞和CD4+中央型記憶T淋巴細胞的頻率較慢性感染者明顯增加，該研究提示HBV特異性CD4+T淋巴細胞反應在功能性治愈中發揮著重要作用。

B淋巴細胞介導的體液免疫應答在HBV清除中也起到重要作用，當應用B淋巴細胞清除療法(如利妥昔單抗)時，HBV再激活風險顯著增加[33]。在CHB患者中，HBsAg特異性B淋巴細胞在外周血中頻率低，非典型性記憶B淋巴細胞(CD21-CD27-)的數量增加且分泌抗體能力較差[34-35]，使用PD-1阻斷劑可部分恢復HBsAg特異性B淋巴細胞的功能[36]。相較于HBsAg特異性B淋巴細胞，HBcAg特異性B淋巴細胞頻率高且分泌抗體能力較強，一項近期研究[13]發現基線抗-HBc水平與干擾素療效密切相關，但造成HBsAg特異性B淋巴細胞與HBcAg特異性B淋巴細胞功能不同的機制尚未闡明。B淋巴細胞的主要作用是針對HBV抗原產生多克隆抗體從而發揮中和作用清除病毒，抗-HBs的出現被視為是CHB功能性治愈的標志之一，近期的一項研究[37]納入感染HBV A基因型并接受NUC治療HBeAg陽性的CHB患者，發現實現HBsAg陰轉的患者中抗-HBs和HBsAg組成的免疫復合物的峰值與ALT峰值相重合，但是在未實現HBsAg陰轉的人群中，兩者的高峰并不重疊，提示抗-HBs在實現功能性治愈中扮演著重要作用。

2.1.2 HBV相關因素與固有免疫 HBV感染可逃避機體的固有免疫[38]。在一項探究HBV垂直感染更易慢性化的研究[9]中，發現親代體內HBeAg可上調子代小鼠肝臟中巨噬細胞上細胞程序性死亡配體1(PD-L1)的表達，從而抑制HBV特異性T淋巴細胞，提示HBeAg在CHB的持續性感染中發揮著關鍵作用。本課題組通過比較CHB四個自然史時期的患者中髓系來源的抑制性細胞(MDSC)的頻率，發現HBeAg陽性的CHB患者中MDSC頻率明顯高于HBeAg陰性患者，體外實驗闡明了HBeAg可以誘導MDSC擴增，進而通過上調吲哚胺2,3-雙加氧酶的表達抑制T淋巴細胞功能[39]。Visvanathan等[40]還發現HBeAg可下調肝細胞、Kupffer細胞和外周單個核細胞上Toll樣受體(TLR)2的表達從而抑制TLR介導的抗病毒免疫。HBeAg除了可調節機體的免疫，Mitra等[41]研究人員發現胞內形式的HBeAg顯著降低干擾素刺激反應元件的活性以及干擾素刺激基因(ISG)的表達，同時在干擾素治療的患者中，HBeAg陽性的患者較HBeAg陰性的患者誘導ISG表達的能力弱。

樹突狀細胞(DC)在抗原呈遞及活化T淋巴細胞過程中起到重要作用，當DC經HBsAg處理后，呈現出免疫耐受的表型，分泌IL-12即激活T淋巴細胞抗病毒的能力也大大減弱[42]，由此推測低HBsAg水平可以恢復DC的部分功能，活化T淋巴細胞的能力增強進而更易發生HBsAg陰轉。NK細胞發揮抗病毒效應主要通過釋放殺傷靶細胞的細胞因子(如干擾素γ、干擾素α等)和發揮抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-medicated cytotoxicity，ADCC)[43]。在PEG-IFN治療中，不論是肝臟內還是外周血中NK細胞功能增強組較未增強組其ALT水平更高且HBsAg水平下降更為明顯[44]。此外，有研究[37]提示ADCC可能在CHB功能性治愈中也發揮一定的作用。

2.2 宿主相關因素影響功能性治愈的機制 在機體免疫系統尚未發育完全之前，HBV感染時年齡越小越傾向于形成HBV持續性感染，但臨床研究[21]表明開始CHB治療越早，功能性治愈率越高，其內在機制并未闡明。近期Fang等[45]研究者發現HBsAg可上調MDSC上的趨化因子受體CCR9，MDSC遷移至胸腺髓質區清除尚未發育成熟的HBsAg特異性T淋巴細胞，提示早期治療有可能會逆轉HBV的免疫耐受狀態從而實現功能性治愈。除此以外，有研究[30-31]表明HBsAg水平并不影響HBV特異性T淋巴細胞反應，患者年齡是影響HBV特異性CD4+、CD8+T淋巴細胞功能的關鍵因素，當年齡<30歲時，HBsAg特異性T淋巴細胞占總HBV特異性T淋巴細胞群的28.26%，但當年齡>30歲時，此比例降至7.14%。

ALT升高主要是由免疫介導，可被視為體內清除病毒的表現，但由于影響ALT因素較多，探索ALT升高的相關機制對于確定CHB治療方案非常必要。有研究[46]顯示，在CHB患者中，HBV特異性CD4+T淋巴細胞以分泌TNFα為主，且該細胞頻率與ALT水平相關，但這群細胞介導的免疫反應會加重肝損傷，而在實現功能性治愈的患者中，HBV特異性CD4+T淋巴細胞以分泌干擾素γ為主。該研究還發現在ALT升高期間，HBsAg下降水平與表面抗原特異性分泌干擾素γ的CD4+T淋巴細胞頻率呈正相關。

2.3 治療方案影響功能性治愈的機制 根據NUC與PEG-IFN聯合治療取得的良好成效提示參與抗病毒與免疫調節的相關機制在實現HBsAg陰轉中發揮重要作用。PEG-IFN通過誘導ISG產生眾多抗病毒蛋白,作用于病毒復制周期的各個階段從而發揮直接抗病毒的作用，同時，體外實驗[47]證實干擾素可促進胞內cccDNA降解。NUC直接靶向病毒的逆轉錄酶，有效抑制HBV的復制，此作用可增強PEG-IFN所激發的固有免疫與特異性免疫細胞功能，有助于HBsAg的清除[48]。

3 小結

目前針對HBV生命周期的抗病毒藥物以及免疫調節類藥物的研發為實現更高比例的功能性治愈帶來了希望。但是關于CHB功能性治愈的機制仍未完全闡明，更為深刻的理解HBV免疫耐受形成機制以及如何消除免疫耐受將為之后實現CHB完全治愈提供可能。