miR-181a在子宮內膜癌中的診斷價值*

貢繼堯，宋梓萌，陳 媛，曾美迪，李世寶,2△

1.徐州醫科大學醫學技術學院，江蘇徐州 221000；2.徐州醫科大學附屬醫院檢驗科，江蘇徐州 221000

子宮內膜癌(EC)是目前全球女性中最常見的惡性腫瘤之一[1]，在中國僅次于宮頸癌，居女性生殖系統惡性腫瘤第二位，而在發達國家居于首位[2]，好發于圍絕經期和絕經后女性。近年來，EC在世界范圍內的發病率持續上升，平均發病年齡也越來越小[3]，但其具體病因尚不清楚。2019年國家癌癥中心統計稱在我國EC的發病率為10.28/10萬，死亡率為1.9/10萬[4]。2020年，全球共有417 367例新診斷病例，由EC導致的死亡人數高達97 370人[5]。目前臨床較為常見的診斷標志物是人卵巢癌抗原(CA125)[6]，但其診斷EC的靈敏度和特異度不佳[7]，使血清腫瘤標志物在臨床上受到極大的限制。而診斷性刮宮術作為其早期診斷的金標準具有侵襲性，因此，亟須發現一種靈敏度高且易獲得的EC診斷標志物來提高EC的診斷效率。

miR-181a是一種微小RNA(miRNA)，廣泛分布于人類細胞中，發揮著調控細胞發育和分化的作用[8]。相關研究證實，miR-181a在EC患者的腫瘤組織中表達水平上升[9]，提示miR-181a具備作為EC標志物的潛能。但組織標本獲取的侵入性限制了其臨床應用，而血清標本獲取相對簡單，并且miRNA在血清中也較為穩定[10]，可以為診斷提供了一種無創的、經濟的方法。因此，本研究擬通過檢測EC患者血清miR-181a水平，探討miR-181a在EC診斷中的價值及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2021年8月至2022年3月在徐州醫科大學附屬醫院確診的EC患者血清標本47份(EC組)，女性體檢健康者血清標本25份(對照組)。EC組患者年齡45～74歲，平均(58.0±7.6)歲；對照組年齡47～68歲，平均(57.4±6,2)歲。納入標準：所有患者經診斷性刮宮檢查證實為EC；納入本研究前未經任何手術、放療、化療等治療。排除標準：其他腫瘤患者；心、肺、腎、神經系統等疾病患者；嚴重精神類疾病患者。本研究獲得徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，所有患者及健康者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2主要試劑和儀器 miR-181a及U6引物、反轉錄試劑盒、PCR試劑盒均購自中國北京天根生化有限公司。TRNzol Universal總RNA提取試劑購自Life technologies公司,PCR擴增儀購自Bio-Rad公司，ABI 7500實時定量PCR儀購自Applied Biosystems公司。

1.3總RNA的提取與實時熒光定量PCR(qPCR) 將存放于-80 ℃的血清標本在室溫下融解，取200 μL血清置于無核酶Ep管中，按照Trnzol Universal總RNA提取試劑說明書提取血清總RNA。使用分光光度計檢測提取RNA的純度和濃度，用于后續實驗。以260 nm和280 nm處的吸光度比值(A260/A280)在1.8～2.0為最佳。按照反轉錄試劑盒說明書配制反應體系(總體系20 μL)將提取的RNA在熒光定量PCR擴增儀上反轉錄為cDNA，反轉錄程序：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min，之后保持10 ℃。得到的cDNA標本保存在-20 ℃冰箱中備用。以1 μL cDNA為模板，按照PCR試劑盒配制反應體系20 μL，PCR條件：95 ℃孵育15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。采用相對定量法，以U6作為內參，每個實驗標本設置3個復孔。采用2-ΔΔCt法計算血清mir-181a的相對表達水平。

1.4統計學處理 采用GraphPad Prism8.0分析軟件進行數據分析。計量資料呈非正態分布，兩組間比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗；計數資料以例數、率表示，組間比較采χ2檢驗。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，分析血清miR-181a對EC的臨床診斷價值，并計算曲線下面積(AUC)。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1EC組和對照組血清miR-181a水平比較 qPCR法檢測miR-181a水平，試驗過程中血清標本未被污染，且未出現引物二聚體或非特異性擴增，結果較可靠。EC組血清miR-181a水平明顯高于對照(P<0.05)，見圖1。

圖1 對照組與EC組血清mir-181a水平比較

2.2miR-181a對EC的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示，血清miR-181a診斷EC的AUC為0.889 8(95%CI：0.816 5～0.963 1，P<0.05)，靈敏度為91.49%，特異度為72.00%，見圖2。

圖2 血清miR-181a診斷EC的ROC曲線

2.3EC患者血清miR-181水平與臨床病理特征的關系 以血清miR-181a的中位數(8.386)為界，miR-181≥8.36的EC患者為高表達組(24例)，miR-181a<8.386的EC患者為低表達組(23例)。高表達組肌層浸潤深度≥2 cm的患者比例高于低表達組(P<0.05)，而兩組年齡、分化程度、免疫組化及有無淋巴結轉移、炎性改變、癌累及其他部位比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 EC血清miR-181a表達水平與臨床病理特征的關系[n(%)]

3 討 論

miRNA是近年來用于腫瘤診斷的新型標志物。miRNA與細胞的增殖、分化、凋亡和代謝密切相關，對機體生理狀態的維持和細胞發育起重要作用[11]。現有不少研究證明，miRNA是影響EC發生、發展的重要因素[12]。BOREN等[13]研究了與EC發生相關的miRNA及其靶信使RNA，發現在正常子宮內膜演變為子宮內膜非典型增生過程中，有13種miRNA存在不同程度的差異性表達，提示miRNA在EC中可能發揮了促癌基因和抑癌基因的功能。此外，miRNA在疾病中特異性表達，且在血清中穩定存在，不易被血液中的核糖核酸酶降解[14]。這些結果提示，血清miRNA作為腫瘤標志物在EC的發生、發展，早期診斷，以及預后預測方面具有十分重要的意義。

miR-181a位于人9號染色體上，不少研究發現miR-181a的差異化表達與腫瘤的發生密切相關[15]，在許多惡性腫瘤中均表達失調。華佳葉等[16]研究發現，miR-181a在急性髓細胞性白血病中高表達，其通過促進HL-60細胞株的增殖來發揮促癌作用。YANG等[17]推測miR-181a在口腔鱗狀細胞癌中發揮了癌基因調控作用。此外，有研究表明，胃癌患者血清中miR-181a表達量明顯上調，可以作為腫瘤標志物進一步研究[18]。國內外均有關于miR-181a對EC影響的報道，但重點均放在了研究miR-181a對EC組織細胞的作用上。有研究人員發現，miR-181a在EC患者的新鮮冰凍組織標本中表達上調，認為miR-181a可能通過抑制其靶基因PR的表達進而調節EC的發生、發展[19]。但是目前關于miR-181a在EC血清中的表達及臨床意義的研究較少。

本研究運用qPCR檢測發現在EC組血清中miR-181a水平明顯高于對照組(P<0.05)，表明miR-181a可能在EC的發生機制中起促癌基因作用。

本課題組認為，在EC發病和進展過程中，因EC組織中腫瘤細胞逃逸或死亡，釋放基因組DNA入血，導致外周血中miR-181a水平升高，miR-181a的這種特異性變化可作為EC診療的無創性分子標記物，對其進行檢測，將有助于EC檢出和治療效果的監控，但其具體調控機制仍需進一步研究。

綜上所述，miR-181a在EC患者血清中水平升高，其可能參與了EC的發生、發展，提示miR-181a是一個潛在的診斷EC的標志物。