湖北省肺炎克雷伯菌耐藥性及高毒力莢膜血清分型研究*

張雅婷，趙改嬋，專 行，朱 明，戴 瑩，史 靜，李國明△

1.湖北省疾病預防控制中心衛生檢驗檢測研究所，湖北武漢 430079；2.武漢大學健康公共衛生學院，湖北武漢 430071；3.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院醫院感染管理科，湖北武漢 430022；4.湖北省襄陽市疾病預防控制中心衛生監測檢驗科，湖北襄陽 441022

肺炎克雷伯菌(KP)為革蘭陰性桿菌，屬腸桿菌科，常存在于人體的上呼吸道和腸道中。當機體免疫力降低時，KP可引起人體肺部、泌尿系統甚至血流感染。KP是臨床上最常見的條件致病菌之一，也是檢出率最高的耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌[1]。為了解湖北省近兩年來KP的耐藥情況，本研究通過對2019-2020年湖北省國家致病菌識別網哨點監測醫院系統收集的臨床分離KP菌株進行藥物敏感性、常見莢膜血清分型、碳青霉烯酶耐藥基因的分布特點等進行分析研究，以期為臨床KP感染治療提供依據，并監測KP耐藥發展趨勢。

1 材料與方法

1.1材料 以2019-2020年湖北省國家致病菌識別網58家哨點監測醫院系統收集的臨床分離的326株KP菌株為研究對象。

1.2儀器和試劑 法國梅里埃公司Vitek MS基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)、Vitek 2 Compact生化鑒定儀，美國Bio-Rad公司PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀，德國凱杰QIAxcel Advanced毛細管電泳儀，美國BD公司BD M50全自動生化藥敏鑒定儀。青島海博公司麥康凱(MAC)培養基、腦心浸液瓊脂(BHA)培養基，法國梅里埃公司質譜α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)試劑盒，美國BD公司革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板，寶生物工程(大連)有限公司Mg2+Free Taq酶、DL2000 Marker、DL1000 Marker。以上均在有效期內使用。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定 以MALDI-TOF MS進行菌株鑒定，從磁珠管中復蘇KP接種至MAC培養基平板上，37 ℃培養24 h。然后挑取單個形態顏色符合的菌落，劃線接種至BHA平板上，37 ℃純培養24 h。從BHA平板上挑取單個菌落涂在靶板的點位中，加2 μL CHCA基質，待干燥后放入MALDI-TOF MS儀器獲取細菌特征性的蛋白質量圖譜，比對后獲取鑒定結果。對質譜鑒定不確定結果用生化鑒定儀進行復核確認。

1.3.2藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗。將KP菌株轉種BHA平板，37 ℃培養16 h后混懸于0.85%氯化鈉溶液中制成0.5麥氏單位懸液，取25 μL 0.5麥氏濁度菌懸液至藥敏培養液中，混勻后滴加一滴藥敏指示劑，小心顛倒混勻后倒入藥敏板中。將制備好的藥敏板放入BD M50全自動生化藥敏鑒定儀中，培養12～18 h后系統自動判定藥敏結果。依據美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)2020年出版的M100抗微生物藥物敏感性試驗標準(第30版)[2]中的折點值對藥敏試驗結果進行判定。

1.3.3高毒力莢膜血清分型及碳青霉烯酶耐藥基因檢測 采用煮沸法提取菌株DNA，擴增4種高毒力莢膜血清分型基因(Wzy-K1、Wzy-K2、Wzy-K54、Wzy-K57)及2種耐藥基因(KPC、NDM)。采用多重PCR檢測高毒力莢膜血清分型，反應體系包括4種正反向引物(1.0 μmol/L)各0.5 μL、MgCl2(25 mmol/L)3.0 μL、Taq酶(5 U/μL)0.4 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL、10×Taq Buffer 2.5 μL、PCR級純水8.1 μL、DNA模板5 μL，擴增條件：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃總延伸10 min。采用PCR檢測碳青霉烯酶耐藥基因KPC、NDM，檢測KPC的反應體系包括正反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)3.0 μL、Taq酶(5 U/μL)0.4 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL、10×Taq Buffer 2.5 μL、PCR級純水10.1 μL、DNA模板5 μL，檢測NDM的反應體系包括正反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)3.0 μL、Taq酶(5 U/μ L)0.25 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL、10×Taq Buffer 2.5 μL、PCR級純水10.25 μL、DNA模板5 μL。KPC及NDM基因的擴增條件：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，36個循環；72 ℃總延伸5 min。莢膜血清分型基因及碳青霉烯酶耐藥基因的引物序列[3-4]見表1，PCR產物經毛細管電泳后，挑取陽性PCR擴增產物進行測序。引物序列合成及擴增產物測序由武漢天一輝遠科技有限公司完成。測序結果采用GenBank BLAST比對確定KP亞型。

表1 高毒力莢膜血清分型基因及碳青霉烯酶耐藥基因的PCR擴增引物

續表1 高毒力莢膜血清分型基因及碳青霉烯酶耐藥基因的PCR擴增引物

1.4統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件對數據進行處理。計數資料以例數、率表示，比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1菌株復核鑒定結果 326株菌株復蘇后經鑒定均為KP，其中42株分離于體液，包括血液35株(83.33%)，胸腔積液3株(7.14%)、膽汁2株(4.76%)，腦脊液1株(2.38%)，腹水1株(2.38%)；其余的284株分離于其他部位，來源于痰液、鼻咽拭子、支氣管肺泡灌洗液等呼吸道標本193株(67.96%)，尿液標本45株(15.85%)，傷口分泌物標本26株(9.15%)，糞便、肛拭子等腸道標本20株(7.04%)。

2.2藥敏試驗結果 326株KP菌株中，對氨芐西林-舒巴坦耐藥142株(43.56%)，對氨曲南耐藥121株(37.12%)，對頭孢他啶耐藥113株(34.66%)，對頭孢噻肟耐藥153株(46.93%)，對美羅培南耐藥60株(18.40%)，對亞胺培南耐藥56株(17.18%)，對厄他培南耐藥62株(19.02%)。標本來源于體液及其他部位的KP對三代頭孢菌素類、碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏試驗結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。產超廣譜β-內酰胺酶的菌株182株(55.83%)；對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株檢出率高達19.02%(62/326)，其中有4株分離于血液、1株分離于腹水。

表2 326株KP的藥敏試驗結果[n(%)]

2.3高毒力莢膜血清分型及碳青霉烯酶耐藥基因檢測 高毒力莢膜血清分型以K2為主，K2檢出率為11.04%(36/326)，K54檢出率為1.84%(6/326)，K57檢出率為5.21%(17/326)，見圖1。碳青霉烯酶耐藥基因KPC的檢出率為10.74%(35/326)，NDM檢出率為1.23%(4/326)，見圖2。碳青霉烯酶耐藥基因KPC陽性產物經測序驗證后均為KPC-2亞型，NDM陽性產物經測序驗證后均為NDM-1亞型。其中，有5株高毒力莢膜血清分型為K2的菌株同時攜帶有KPC基因、有2株高毒力莢膜血清分型為K54的菌株同時攜帶有KPC基因，見表3。另有2株菌株同時攜帶KPC及NDM碳青霉烯酶耐藥基因。

注：01～12代表泳道編號；泳道01、泳道08、泳道09依次為K2、K54、K57陽性擴增產物，泳道12為Marker。圖1 高毒力莢膜血清分型毛細管電泳結果

注：01～07代表泳道編號；圖A為碳青霉烯酶KPC耐藥基因(泳道01為KPC陽性擴增產物，泳道05為Marker)；圖B為碳青霉烯酶NDM耐藥基因(泳道01為NDM陽性擴增產物，泳道04為Marker)。圖2 碳青霉烯酶耐藥基因KPC、NDM毛細管電泳結果

表3 不同高毒力莢膜血清分型KP菌株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因檢測結果

3 討 論

本研究通過對湖北省2019-2020年不同醫院收集的KP進行分析發現，其對多種抗菌藥物耐藥，對頭孢噻肟、頭孢他啶耐藥率分別為46.93%(153/326)、34.66%(113/326)，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)的檢出率高達19.02%(62/326)，頭孢噻肟耐藥率和CRKP檢出率均高于2019年全國細菌耐藥監測報告中的31.6%和12.4%[5]，表明KP對各種藥物耐藥率呈上升趨勢，在臨床診療中必須結合當地的細菌耐藥性合理選擇頭孢類抗菌藥物。

近年來KP引起的血流感染發生率居高不下，位居革蘭陰性菌血流感染的第2位[6]。特別是CRKP引起的血流感染治療困難、病死率高[7]，更需要引起重視，減少血流感染CRKP病例的產生。其他體液如腦脊液、胸腔積液、腹水中分離出KP與其引起血流感染類似，多見于免疫力低下或有基礎疾病患者。本研究對分離自血液、腦脊液、胸腔積液、腹水等體液中的KP與分離自其他部位的耐藥分布情況進行了比較，結果顯示，標本來源于體液及其他部位的KP對三代頭孢菌素類、碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性差異無統計學意義(P>0.05)。

KP在臨床上帶來的挑戰主要有兩方面：耐藥和毒力。就耐藥而言，碳青霉烯類藥物是治療KP感染的最后策略，隨著碳青霉烯類藥物的普遍使用，CRKP檢出率日益增高。本研究中的CRKP檢出率要略低于與郭玲等[8]的24.3%，這可能與樣本量的多少和地域間的差別有關。碳青霉烯酶耐藥基因KPC在KP菌株中的檢出率與以往報道研究基本一致[9]，本研究中KPC基因全部為KPC-2亞型，表明KPC-2亞型是湖北省主要的碳青霉烯酶耐藥基因。耐藥基因的獲得主要有兩種方式，一是通過突變獲得，二是通過菌株內部的可移動遺傳元件進行水平轉移，如轉座子、可移動元件等[10]。KPC基因是通過質粒介導的耐藥基因，含有一個完整的轉座子，可以在相同的宿主間進行質粒轉移，也可以以整個質粒水平轉移的方式在不同細菌間傳播[11]。有研究表明，KP的KPC耐藥基因是同一質粒水平傳播引起的[12]，可能造成耐藥基因播散引起的醫院感染暴發。為了防止耐藥基因的相互傳播，在臨床用藥上合理謹慎選擇抗菌藥物是非常有必要的。在毒力方面，主要問題是高毒力KP的存在，其一般呈現出毒力高、耐藥率低的特點，不僅可以導致嚴重的肝膿腫、菌血癥，并且致病部位可以轉移到神經系統、眼部和肺部[13-14]。通常采用拉絲試驗來判斷KP菌株是否為高毒力KP[15]，拉絲試驗中對結果的判定受試驗操作人員主觀影響較大，而拉絲與否與莢膜多糖分泌息息相關。目前可以檢出的莢膜血清分型超過78個，最常見的血清分型是K2、K1。而造成嚴重感染的高毒力KP其莢膜血清分型大部分也都是K2與K1，原因可能與K2、K1型的KP所分泌的莢膜多糖成分能夠抵抗吞噬細胞的吞噬能力有關。雖然高毒力KP多呈現出耐藥率低的特點，但已有研究報道高毒力KP正在通過質粒介導的耐藥基因轉移從而獲得耐藥性基因[16]，本研究中也同時發現K2、K54型高毒力KP攜帶KPC耐藥基因，對于這一部分菌株本課題組后續還需進行進一步的深入研究，進一步從分子層面上研究KPC耐藥基因的傳播情況和高毒力KP的致病機制。

CRKP作為攜帶碳青霉烯酶耐藥基因的超級細菌，檢出率日益增高，本研究中發現了2株同時攜帶KPC和NDM耐藥基因的KP，均為痰液標本，且這2株KP對氨芐西林-舒巴坦、亞胺培南、氨曲南等均耐藥，提示攜帶多個耐藥基因的KP已在多個地區之間播散，預防多重耐藥菌的形成及播散已經迫在眉睫。

綜上所述，湖北省KP對大多抗菌藥物耐藥且耐藥率呈上升趨勢，并出現了攜帶KPC耐藥基因的高毒力KP，在臨床診療中必須加強對CRKP的監測，結合細菌耐藥性合理選擇抗菌藥物。