基于GC-MS的良惡性腹水患者代謝組學(xué)差異分析*

唐 杰，殷晨燕，許尤琪△

1.江蘇省第二中醫(yī)院/南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210017；2.江蘇省中醫(yī)院藥劑科，江蘇南京 210029

腹水的病因復(fù)雜，可分為良性和惡性，主要表現(xiàn)為胸悶、憋氣或腹脹等，但臨床上對(duì)腹水的病因診斷存在較大的難度，如何準(zhǔn)確有效鑒別腹水性質(zhì)對(duì)臨床診治具有重要的意義[1]。代謝組學(xué)是一種新型組學(xué)技術(shù)，可檢測(cè)代謝物的轉(zhuǎn)化與水平變化，有利于發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的代謝通路及潛在靶標(biāo)、作用位點(diǎn)，從而為臨床診治提供重要的依據(jù)[2]。而氣-液相質(zhì)譜(GC-MS)是代謝組學(xué)常用的檢測(cè)方法，可發(fā)現(xiàn)腫瘤組織及癌旁組織間的代謝差異，有利于了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展情況，為臨床診治尋找潛在靶點(diǎn)，但目前關(guān)于良惡性腹水代謝組學(xué)差異的研究較少[3]。本研究通過GC-MS檢測(cè)良惡性腹水患者代謝情況，尋找二者的代謝組學(xué)差異，以期為臨床診治提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2021年6月江蘇省第二中醫(yī)院收治的58例惡性腹水患者作為惡性組，其中男30例，女28例；年齡20～74歲，平均(47.62±7.85)歲；體質(zhì)量指數(shù)17.65～28.98 kg/m2，平均(22.71±2.68)kg/m2；腹水病因：肝癌28例，胃癌14例，腸癌10例，膽管癌6例。另選取同期收治的58例良性腹水患者作為良性組，其中男34例，女24例；年齡21～73歲，平均(46.92±7.67)歲；體質(zhì)量指數(shù)17.82～28.65 kg/m2，平均(22.53±2.59)kg/m2；腹水病因：肝硬化28例，胃腸道疾病18例了，結(jié)核性腹膜炎12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)臨床癥狀、病史、實(shí)驗(yàn)室、病理學(xué)等檢查確定腹水的良惡性；(2)年齡>18歲，無精神病病史；(3)所有患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有糖尿病等原發(fā)性代謝性疾病；(2)孕產(chǎn)婦或哺乳期；(3)檢查前3個(gè)月內(nèi)有免疫、激素、放化療等治療史。兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)江蘇省第二中醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑 Agilent 6890/5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5 MS氣相毛細(xì)管色譜柱、Milli-Q Gradient超純水系統(tǒng)購自美國Agilent科技有限公司，低溫冷凍冰箱、樣品濃縮儀購自英國Stuart公司，微型漩渦混合器、高速冷凍離心機(jī)購自美國Millipore中國有限公司，數(shù)控超聲儀、箱式電阻爐、烘箱購自上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。甲氧胺、N-O-雙(三甲硅基)三氟乙酰胺、L-2-氯苯丙氨酸、十七酸購自美國Sigma-Aldrich 公司，甲醇、氯仿購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2標(biāo)本采集及處理 治療前對(duì)患者行腹腔穿刺，抽取10 mL腹水并置入已編號(hào)的凍存管，迅速投入液氮罐內(nèi)低溫保存、備用。檢測(cè)前統(tǒng)一解凍處理腹水標(biāo)本，加入3倍量生理鹽水勻漿，加500 μL甲醇渦旋1 min，置-20 ℃冰箱沉淀蛋白后離心10 min(12 000 r/min，4 ℃)；取200 μL上清液氮?dú)獯蹈桑尤?5 mg/mL甲氧胺80 μL振蕩30 s，搖床(250 r/min，30 ℃)中行甲氧胺對(duì)羰基的封閉反應(yīng)1.5 h，再加80 μL的雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺振蕩30 s，70 ℃烘箱中放置1 h，室溫中放置1 h后待用。

1.2.3GC-MS檢測(cè) 取1 μL標(biāo)本行GC-MS分析，設(shè)質(zhì)譜參數(shù)[電子碰撞電離電壓70 eV，四級(jí)桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，溶劑延遲5 min，質(zhì)譜全掃描范圍30～600質(zhì)荷比(m/z)，方式為全掃描]，設(shè)液相色譜參數(shù)(色譜柱DB-5MS毛細(xì)管柱，進(jìn)樣量1.0 μL，進(jìn)樣口溫度270 ℃，接口溫度260 ℃，載氣99.999%純氦，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣方式為不分流)，色譜柱程序升溫檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 (1)數(shù)據(jù)處理。所有原始數(shù)據(jù)經(jīng)自帶Agilent MSD工作站轉(zhuǎn)化為Net CDF后導(dǎo)入R軟件行XCMS工具箱處理，最終形成由標(biāo)本名稱、峰指數(shù)(保留時(shí)間-質(zhì)荷比)、峰面積組成的三維矩陣表。(2)模式識(shí)別。三維矩陣表導(dǎo)入SIMCA-P11.5(Umetrics,Umea,Sweden)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析法(PLS-DA)處理，采用正交偏最小二乘法判別分析法(OPLS-DA)來尋找差異變量，以變量對(duì)模型的重要性(VIP，VIP值越大說明貢獻(xiàn)越大)>1.0選擇多維統(tǒng)計(jì)上的差異變量進(jìn)行驗(yàn)證。采用7次交叉驗(yàn)證和影響排列檢驗(yàn)(RPT)對(duì)所得差異性代謝物的多維統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以VIP>1.0和P<0.05，結(jié)合錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率檢驗(yàn)的q<0.05確定最終差異性代謝物。(3)代謝通路分析。依據(jù)多維統(tǒng)計(jì)給出的差異變量檢索美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)數(shù)據(jù)庫得到對(duì)應(yīng)的化合物，用標(biāo)準(zhǔn)品鑒定差異表達(dá)代謝物，最后檢索京都基因與基因組百科全書(KEGG)庫和人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)得到對(duì)應(yīng)的代謝通路，并通過基礎(chǔ)代謝庫確定[4-5]。

2 結(jié) 果

2.1兩組腹水代謝物檢測(cè)結(jié)果比較 離子流色譜圖顯示惡性組和良性組腹水中均檢測(cè)到多種代謝物(每個(gè)峰代表≥1個(gè)代謝物)，見圖1。

注：A為惡性組腹水離子流色譜圖；B為良性組離子流色譜圖。圖1 兩組腹水患者離子流色譜圖比較

2.2兩組代謝模式比較 PCA圖(圖2A)顯示良性組和惡性組質(zhì)控標(biāo)本集中、穩(wěn)定性好、可靠性高，兩組標(biāo)本多位于95%置信區(qū)間的橢圓范圍內(nèi)，顯示兩組代謝差異顯著并區(qū)分明顯；OPLS-DA圖(圖2B)顯示，良性組和惡性組代謝差異顯著分離(升高)；OPLS-DA載荷圖(圖2C)顯示，兩組均有大量代表代謝物的圓點(diǎn)且靠近兩邊三角形，即兩組間有大量差異性代謝物且差異顯著；7次交叉驗(yàn)證結(jié)果顯示，兩組OPLS-DA模型中，R2X=0.28，R2Y=0.96，Q2=0.92，說明模型具有較好的穩(wěn)定性和可靠性；OPLS-DA的RPT圖(圖2D)顯示，兩組OPLS-DA模型經(jīng)200次隨機(jī)排列計(jì)算后，顯示右側(cè)的點(diǎn)均高于左側(cè)相同形狀的點(diǎn)，累積Q2=0.39，模型穩(wěn)定可靠。

注：A為PCA圖；B為OPLS-DA圖；C為OPLS-DA載荷圖；D為OPLS-DA的RPT圖。圖2 兩組腹水患者代謝模式比較

2.3兩組差異性代謝物分析 OPLS-DA濾除噪音后，以第一主成分的VIP值(閾值>1)、P值及其校正的q值確定非差異性代謝物有13個(gè)，差異性代謝物有34個(gè)(q<0.05)，見表1。

表1 兩組代謝物分析

續(xù)表1 兩組代謝物分析

2.4兩組差異性代謝物的代謝通路篩選 將差異性代謝物通過KEGG庫映射獲得與之相關(guān)的代謝通路，經(jīng)超幾何分布統(tǒng)計(jì)，其中谷氨酸和谷氨酰胺(L-谷氨酸、L-谷氨酰胺)、半乳糖(D-果糖、D-半乳糖、甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖酸)、磷酸戊糖(葡萄糖酸內(nèi)酯、葡萄糖、核糖、氨基葡萄糖)及谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸(L-天冬氨酸、L-谷氨酸、N-乙酰-L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺)4條代謝通路的代謝物在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.35×10-3、3.86×10-3、2.06×10-2、1.29×10-3)，見表2。

表2 兩組代謝物的代謝通路分析

3 討 論

與良性腹水比較，惡性腹水因癌細(xì)胞已失去正常細(xì)胞的生理功能，其異常快速生長的特性會(huì)引起機(jī)體多項(xiàng)生命活動(dòng)異常[6-7]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，癌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致糖代謝、脂肪代謝、嘌呤嘧啶代謝等代謝異常的發(fā)生[8-9]，如Warburg效應(yīng)，即正常細(xì)胞會(huì)借助線粒體產(chǎn)生的腺苷三磷酸來獲取能量，癌細(xì)胞則靠糖酵解作用為自身提供能量及生長所需的代謝物，癌組織糖酵解率可達(dá)正常組織的200倍，提示了解相關(guān)代謝途徑有助于深入了解癌癥發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并可促進(jìn)新的診治方法出現(xiàn)[10-11]。

代謝組學(xué)通過以高分辨率分析儀和多維統(tǒng)計(jì)的方法分析細(xì)胞、組織或體內(nèi)的代謝物全局性來揭示生命活動(dòng)，可反映生物機(jī)體在受到外界干擾時(shí)機(jī)體的應(yīng)答反應(yīng)，從而了解疾病發(fā)生機(jī)制和藥物作用機(jī)制[12-13]。有研究報(bào)道，GC-MS是代謝組學(xué)中應(yīng)用較廣的技術(shù)，可對(duì)組織、大便、體液等樣品中的小分子物質(zhì)進(jìn)行分離、檢測(cè)和定量，從而發(fā)現(xiàn)生理狀況下的代謝物的變化情況[14-15]。本研究PCA顯示，惡性組和良性組的代謝輪廓有顯著性差異，表明良惡性腹水患者存在代謝差異，這與王淑鳳等[16]研究顯示良惡性疾病(肝硬化和肝細(xì)胞癌)患者有代謝差異的結(jié)論相似。這可能是由于細(xì)胞癌變過程中，癌組織可能會(huì)引起機(jī)體代謝異常，尤其是會(huì)促使機(jī)體產(chǎn)生大量的能量和物質(zhì)，以維持癌組織的異常快速生長；同時(shí)相關(guān)研究認(rèn)為能量和物質(zhì)的大量異常產(chǎn)生也是細(xì)胞癌變的根本原因[17-18]。

本研究進(jìn)一步分析良惡性腹水患者代謝產(chǎn)物及通路的差異，OPLS-DA顯示惡性組和良性組有34個(gè)差異性代謝產(chǎn)物；經(jīng)KEGG庫和HMDB映射顯示，與之相關(guān)且在良惡性腹水中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝通路有4條，分別為谷氨酸和谷氨酰胺(L-谷氨酸、L-谷氨酰胺)、半乳糖(D-果糖、D-半乳糖、甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖酸)、磷酸戊糖(葡萄糖酸內(nèi)酯、葡萄糖、核糖、氨基葡萄糖)及谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸(L-天冬氨酸、L-谷氨酸、N-乙酰-L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺)通路，表明與良性腹水比較，惡性腹水主要存在糖代謝、氨基酸代謝差異，其相關(guān)代謝通路可能與惡性腹水病程進(jìn)展密切相關(guān)。

谷氨酸和谷氨酰胺代謝通路：谷氨酸和谷氨酰胺參與人體內(nèi)多種代謝，其在癌組織中的主要作用是促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來提高癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性[19-20]。故本研究推測(cè)惡性腹水中谷氨酸和谷氨酰胺代謝異常，可能是為了維持癌組織的活動(dòng)，如促使癌細(xì)胞侵襲、脫落、轉(zhuǎn)移等。

磷酸戊糖代謝通路：磷酸戊糖來源于葡萄糖的氧化分解，也是核酸的主要成分之一，癌細(xì)胞快速增殖需要大量復(fù)制DNA[2-3]。故本研究推測(cè)惡性腹水中磷酸戊糖代謝異常，可能是為了用于癌細(xì)胞合成大量DNA。

半乳糖代謝通路：半乳糖可轉(zhuǎn)化為葡萄糖分解供能，一般在腸道中由13-乳糖酶分解乳糖產(chǎn)生，而代謝中的半乳糖則主要從尿苷二磷酸葡萄糖生成，同時(shí)癌組織的能量主要由葡萄糖直接酵解提供，無需再將半乳糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖[12-13]。故本研究推測(cè)惡性腹水中半乳糖代謝異常，可能是為了獲得癌細(xì)胞快速增殖所需的物質(zhì)。

谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸代謝通路：相關(guān)研究顯示，癌組織中的谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸與糖代謝、氨基酸代謝有關(guān)，谷氨酸經(jīng)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化可生成天冬氨酸，天冬氨酸可為嘌呤和嘧啶的合成提供底物，使癌細(xì)胞快速大量復(fù)制其增殖所需DNA；同時(shí)丙氨酸進(jìn)入血液后被運(yùn)往肝臟，在肝臟中丙氨酸通過聯(lián)合脫氨基作用釋放氨基生成丙酮酸，丙酮酸經(jīng)糖異生途徑生成葡萄糖，為癌細(xì)胞快速增殖提供能量[14-15]；故本研究推測(cè)惡性腹水中谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸代謝異常，可能是為了給癌細(xì)胞增殖提供物質(zhì)及能量供應(yīng)。

綜上所述，與良性腹水比較，惡性腹水主要存在糖代謝、氨基酸代謝改變，能量通路中的有關(guān)Warburg效應(yīng)的代謝途徑變化明顯，這些代謝通路改變可能與惡性腹水病程進(jìn)展密切相關(guān)，為失調(diào)的癌細(xì)胞提供生長和生存所需的各種條件，通過GC-MS等代謝組學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)相關(guān)代謝物及代謝通路有望成為惡性腹水新的診治方向。