食品大豆轉基因成分能力驗證結果分析與討論

隨著轉基因技術的飛速發展，轉基因產品市場不斷拓展，越來越多的轉基因農產品商品化[1]。轉基因技術的發展在食品中的應用也越來越廣泛，已經走入了大眾生活。為了提升實驗室對于植物及其加工產品中轉基因成分的檢測能力，本實驗室參加了中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織的糧食轉基因檢測能力驗證活動。

本次能力驗證主要檢測大豆內源基因Lectin（植物凝集素）、pCaMV35S（花椰菜花葉病毒35S啟動子）、tNOS（來源于農桿菌的胭脂堿合成酶基因終止子）、CP4-EPSPS（根癌農桿菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因）[2-3]。本次主要采用實時熒光PCR方法進行檢測，實時熒光PCR技術是近年來定量PCR技術中興起的最新定量檢測技術[4]。

1 材料與方法

1.1 檢驗依據

本次實驗根據《植物及其加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法》（SN/T 1204—2016）[2]和中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心的《ACAS—PT1138（2021）糧食轉基因檢測能力驗證參試指導書》進行檢測。

1.2 材料與設備

樣品：大豆轉基因樣品共2瓶，瓶號為21-E577、21-F956。樣品由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供。陽性對照：大豆陽性對照從實驗室之前參加能力驗證為陽性樣品保存所獲；陰性對照：非轉基因大豆；空白對照：超純水。

試劑：實驗室超純水；植物DNA提取試劑盒；引物；探針；2×Taq PCR預混試劑（不含染料）；2×Taq PCR預混試劑；dNTPs溶液；Taq DNA聚合酶（含分裝Mg2+）等。

設備：實時熒光PCR儀（美國安捷倫儀器公司）；研磨器、電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；微型離心機（德國HETTICH）；旋渦振蕩器（德國IKA）；二級生物安全柜A2（新加坡ESCO）；紫外分光光度計（島津儀器（蘇州）有限公司）；微量移液器（德國普蘭德）；高壓蒸汽滅菌器（日本株式會社平山制作所）；法國AES均質器（法國AES儀器有限公司）；超純水機（Thermo Fisher SCIENTIFIC公司）；酸度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；藥品保存箱（青島Haier）。

1.3 實驗方法

1.3.1 取樣和制樣

樣品為粉末狀，離心管密封包裝。根據組織方作業指導書要求，將樣品混勻后取樣檢測。

1.3.2 樣品DNA的提取與純化

（1）提取。根據購置的DNA試劑盒進行樣品21-E577、21-F956中DNA的提取。取干重組織20 mg，加入400 μL緩沖液1和6 μL核酸內切酶，渦旋振蕩，室溫放置；加入130 μL緩沖液2，充分混勻，渦旋振蕩；離心，將上清移至新的離心管中；加入1.5倍體積的緩沖液3，立即充分振蕩混勻。

（2）純化。將上述提取所得溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），離心，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入600 μL漂洗液，離心，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。重復操作一次；將吸附柱放回收集管中，離心，倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱轉入干凈的離心管中，懸空滴加200 μL洗脫緩沖液，室溫放置，離心，將溶液收集到離心管中。

1.3.3 DNA濃度測定和定量

樣品21-E577、21-F956DNA用紫外分光光度計測定在260 nm和280 nm處的吸收值，分別計算核酸的純度和濃度。DNA的純度比值應在1.7～1.9，濃度不低于 20 ng·μL-1。

1.3.4 實時熒光PCR反應體系配制

先取4個離心管分別標記Lectin基因、pCaMV35基因、tNOS基因、CP4-EPSPS基因，由于每個基因均有陽性、陰性、空白、21-E577樣品和21-F956樣品5個體系，每個離心管按表1反應體系的5倍量分別用移液器添加10PCR緩沖液、dNTP、上引物、下引物、探針、Taq酶和超純水，完成后用微型離心機快速旋轉一會兒靜置。取20個PCR反應管分別標記Lectin-陽性、Lectin-陰性、Lectin-空白、Lectin-577、Lectin-956，pCaMV35S-陽 性、pCaMV35-陰 性、pCaMV35-空 白、pCaMV35- 577、pCaMV35- 956、tNOS-陽性、tNOS-陰性、tNOS-空白、tNOS-577、tNOS-956、CP4-EPSPS-陽性、CP4-EPSPS-陰性、CP4-EPSPS-空白、CP4-EPSPS-577和CP4-EPSPS-956，分別分裝各自的基因20 μL體系，再分別添加5 μL的DNA模板，蓋上蓋子后上機。

表1 實時熒光PCR反應體系表

1.3.5 實時熒光PCR反應程序

實時熒光PCR反應參數為：50 ℃/2 min，1個循環；95 ℃/10 min，1個循環；95 ℃/15 s和60 ℃/60 s，40個循環。

2 結果與分析

2.1 實時熒光定量PCR數據結果

實時熒光定量PCR數據結果見表2。由表2可知，陽性對照Ct值結果均小于30，陰性對照Ct值結果均小于30，PCR反應體系正常，結果有效。

表2 實時熒光定量PCR數據結果表

2.2 樣品Ct值

樣品21-E577、21-F956 Ct分析結果見表3。由表3可知，編號為21-E577樣品的內源基因lectin Ct值為 22.67，pCaMV35S Ct值為 26.42，tNOS Ct值為26.62，CP4-EPSPS Ct值為 23.27，編號為 21-F956樣品的內源基因lectin Ct值為22.18，pCaMV35S Ct值為26.66，tNOS Ct值為 26.92，CP4-EPSPS Ct值為 23.08。

表3 樣品分析Ct值

綜合Ct值結果，依據SN/T 1204—2016標準中結果判定及表述，測試樣品檢測Ct值小于或等于36，內源基因檢測Ct值小于或等于30，判定該樣品含有所檢基因或品系。判定21-E577檢出lectin基因，檢出pCaMV35S基因、tNOS基因和CP4-EPSPS基因。判定21-F956檢出lectin基因，檢出pCaMV35S基因、tNOS基因和CP4-EPSPS基因。

3 結論與討論

本次能力驗證取得滿意結果，表明實驗室已具備開展植物及其加工產品中轉基因成分的檢測能力。能力驗證工作要求嚴格，需要檢測人員不斷提升自己的操作水平，不斷積累檢測經驗。收到能力驗證樣品后，按照作業指導書要求室溫保存。取樣時按照要求取樣，避免對環境造成污染。確保能力驗證過程中所用到的設備狀態正常，試劑中用到Taq酶，應提前開啟制冰機，制冰后將所用的試劑放置冰盒中，保證試劑的有效性。配制體系應避免氣溶膠污染，每個樣品的處理均在生物安全柜內操作[5]，實驗人員做好防護措施，加樣過程中注意移液器的使用，按照設定的順序加樣，繞開非目標管口，避免氣溶膠逸散造成假陽性結果的出現，操作過后的生物安全柜應及時開啟紫外燈進行消毒，避免核酸片段造成污染[6-7]。

綜上，通過此次能力驗證，實驗室對大豆中轉基因成分的實時熒光定量PCR檢測方法有了更進一步的掌握和提升，對于食品轉基因成分領域中的其他資質能力，本實驗室會在后續的外部質量控制活動中積極尋求并主動參與，保證實驗室在食品轉基因成分的持續檢測能力。