油茶餅粕多酚提取物對紅提致病菌抑菌活性的研究

油茶又名茶籽樹、油茶樹，與橄欖油、椰子、油棕并稱為世界四大木本油料植物[1]。油茶餅粕為茶籽榨油后的殘渣，殘留有數種生理活性物質，如多酚、黃酮、皂苷和礦物質等。其中，多酚羥基吞噬自由基的能力強，具有高抗氧化性能[2]。油茶多酚作為植物源防腐劑，能減少常見的、能引起食物發生變質的細菌繁殖，有助于提升食品品質，同時多酚本身具有多種保健功能，能滿足人們的健康需求。多酚作為植物源防腐劑能夠減少傳統化學防腐劑給人們身體健康造成的危害，其應用日趨廣泛[3]。紅提形態為漿果，含糖量與含水量很高，非常適合各種微生物的生長，因此新鮮紅提極易腐敗變質，給儲藏與運輸帶來了許多的困難[4]。青霉病是一種由真菌浸染導致水果腐爛變質的常見病害，是新鮮紅提在采收后貯藏與運輸過程中的重大病害，會導致嚴重的經濟損失。在紅提運輸與儲存途中，生理退化、機械損傷與病原菌感染等[5]往往會導致其保質期縮短，降低紅提的商品價值，故紅提采收后病害控制對其商品品質與延長貨架期具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：油茶餅粕、紅提，市售；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，實驗室保藏菌株。

試劑：甲醇、無水乙醇（均為分析純），天津市北聯精細化學品開發有限公司；丙酮（分析純），成都金山化學試劑有限公司；沒食子酸（色譜純），Sigma；牛肉膏、蛋白胨（均為分析純），北京奧博星生物技術有限公司；氯化鈉（分析純），天津市大茂化學試劑廠。

儀器：BXM-30R立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DHG-9040A新型電熱恒溫鼓風干燥箱，寧波江南儀器廠；HH-（S）6數顯恒溫水浴鍋，金壇市安普實驗儀器廠；SPX-BSH-III智能生化培養箱，寧波江南儀器廠；SW-CJ-IF超凈工作臺，上海新苗醫療器械制造有限公司；HN-650Y超聲粉碎機，上海汗諾儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油茶餅粕干重測定

根據國標GB 5009.236—2016測定茶粕干重。取5 g樣品，精確至0.001 g，置于干燥恒重玻璃容器，于103 ℃±2 ℃的烘箱中1 h，再夾取玻璃皿移入干燥器中，靜置冷卻至室溫，精確稱量至0.001 g。反復進行上述步驟，每次重復加熱時長為0.5 h，待接連兩次復烘稱重差分別不超過2 mg。水分及揮發物含量（X）以質量分數表示，計算公式為

式中：X為水分及揮發物含量，%；m1為加熱前容器和所稱取原料的重量，g；m2為加熱后容器和所稱取樣品的質量，g；m0為玻璃容器的質量，g；計算結果精確到0.01。

1.2.2 超聲輔助有機溶劑提取油茶餅粕中的多酚

準確稱量茶粕原料5.00 g±0.01 g，以1∶15的料液比分別加入50%乙醇，置于超聲粉碎機中，70 ℃提取0.5 h，冷卻過濾，重復3次，樣品在4 ℃下儲存[6]。

1.2.3 總酚含量的測定（采用福林酚比色法）

（1）標準曲線的繪制。配制100 μg·mL-1的沒食子酸標準品母液，各吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL的沒食子酸標準品母液于10 mL容量瓶中，并添加1 mL福林酚溶液及2 mL 15%（m∶m）NaCO3試劑，定容后室溫下反應2 h，760 nm波長下測定標準品溶液的吸光度值。

（2）樣品測定。移取0.5 mL樣品于10 mL容量瓶中，加入福林酚溶液1 mL和15% NaCO3溶液2 mL，定容后室溫下反應2 h，測樣品反應液的A760[6]。總酚含量計算公式為

式中：C為標準曲線計算的多酚含量，mg·mL-1；D為稀釋倍數；V總為提取液體積，mL；W為稱取樣品質量，g；X為油茶餅粕中水分及揮發物含量，%。

1.2.4 病原菌的分離與純化

使用組織分離法[7-8]剪取其病腱交界處組織若干，并消毒殺菌。用75%的乙醇對病變組織進行浸泡消毒30 s，待吹干水分時放入無菌水洗滌30 s，干燥后用2.5%的次氯酸鈉溶液殺菌30 s，晾干水分，放入無菌水洗滌30 s，晾干水分后再進行無菌水洗滌30 s。

取已消毒的病樣組織接種至PDA培養基上，于28 ℃智能生化恒溫培養箱培養10 d，每日觀察菌落形態。長出菌落后挑取菌絲于PDA培養基上，于28 ℃恒溫培養箱培養7 d，每日觀察菌落生長情況。長出菌絲后，接種于PDA培養基上進行純化。使用顯微鏡進行形態觀察后接入斜面培養基進行保種儲藏。

1.2.5 油茶餅粕中多酚粗提物的抑菌性質研究

油茶餅粕粗提物用旋轉蒸發儀蒸去有機溶劑后進行冷凍干燥，得到多酚粉末粗成品。

（1）培養基的制備。①PDA培養基：200 g新鮮去皮土豆，加入蒸餾水煮沸30 min，8層紗布過濾，然后加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，定容至1 000 mL，自然pH，滅菌冷卻后，每150 mL培養基加入3 mL雙抗，備用。②牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，1.5%瓊脂，水1 000 mL?？刂婆囵B基的酸堿度在7.0～7.2，置每個三角瓶大約150 mL，滅菌備用。

（2）抑菌效果測定。制作直徑大小為6 mm濾紙片，滅菌后浸入 0 mg·mL-1、 50 mg·mL-1、100 mg·mL-1、150 mg·mL-1和 200 mg·mL-1的茶多酚水溶液中浸泡30 min，吹干備用。準確吸取0.1 mL菌懸液于平板培養基上，涂布均勻，干后將預先浸泡多酚粗提物溶液的濾紙片貼于表面，每皿4片，重復5組。將貼好濾紙片的含菌平板置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，測定平板上抑菌直徑大小[9]。

（3）油茶餅粕多酚粗提物最低抑菌濃度的測定。配 制 100.0 mg·mL-1、50.0 mg·mL-1、25.0 mg·mL-1和12.5 mg·mL-1的油茶餅粕多酚水溶液，并各移取5 mL至無菌平皿中，加入約15 mL培養基，搖勻凝固后，分別移取100 μL菌懸液于平板上涂布均勻，至于37 ℃培養24 h，觀察細菌生長情況。

（4）作用時間對油茶餅粕多酚粉末粗成品抑菌活性的影響。取最低抑菌濃度多酚水溶液1 mL分別與0.5 mL的供試菌懸液混合，振蕩混合均勻。當作用時間1 h、3 h、6 h時倒入培養基中培養。制備好的含菌培養基分別在37 ℃培養24 h，取出分別數菌落數，計算抑菌率[10]。抑菌率計算公式為

抑菌率=（對照皿菌落數-實驗皿菌落數）/對照皿菌落數×100% （3）

（5）作用溫度對油茶餅粕多酚粗提物抑菌活性的影響。最低抑菌濃度油茶餅粕多酚水溶液于40 ℃、70 ℃、100 ℃下分別保溫30 min，用濾紙片法測出其抑菌圈直徑大小，比較溫度對茶多酚抑菌效果作用[11]。

2 結果與分析

2.1 油茶餅粕的干重

由表1可知，油茶餅粕中水分及揮發物含量為（9.51±0.03）%。

表1 油茶餅粕原料的干重表

2.2 油茶餅粕粗提物的總酚含量

由沒食子酸標準品所得標準曲線見圖1。其回歸方程為y=0.167 1x-0.018 3，R2為0.991 9，響應度高。采用乙醇輔助超聲波提取法提取油茶餅粕多酚，提取物中總酚含量為 732 μg·g-1。

圖1 沒食子酸標準曲線圖

2.3 紅提病原菌的分離結果

從病變紅提組織中分離的菌種結果如圖2所示，共分離出3種顏色、形態不同的菌種。經分離純化后培養的性狀如圖3所示，菌株CoF1菌落呈圓形，初期氣生菌絲成白色，棉花絲狀，菌落正反面有明顯的放射紋路，生長后期，菌絲成淺灰白色，中央有黑色素沉淀，底部有白色顆粒狀物質，可能為分生孢子囊泡。菌株CoF1的孢子為無色透明，形態為鐮刀型，孢子大小為（1.3×1.1）μm到（9.8×1.2）μm，菌絲少分支，無假根及匍匐菌絲頂生內含孢子量多，菌株CoF1可能屬于毛霉屬。如圖4所示，菌株CoF2菌落呈點狀圓盤形，初期有青白色的短小菌絲，且中央菌落呈現點滴狀的金屬光澤，PDA培養基外圍分布多而不粘連的小菌落，病原菌為孢子易飛散的青霉。接種初期，有較多孢子飛散于培養基表面，分生成細小的菌落。生長后期，菌絲已不明顯，菌落表面覆蓋厚重青綠色青苔狀粉末，為成熟的孢子聚集體。其孢子為淺青或透明色，橢圓形，孢子大小為（1.1×0.9）μm到（1.5×1.5）μm。菌絲尾部呈現明顯的掃帚狀分叉，菌絲及其分生孢子梗均有橫隔，菌株CoF2可能屬于青霉屬。如圖5所示，菌株CoF3菌落呈現團狀，初期氣生菌絲呈現雪花棉絮形團狀，菌落正反面均無規則輪廓。生長后期，菌絲變成石灰色，背面有黑色點狀物質，可能為分生孢子囊泡。雪花棉絮團狀病原菌的孢子呈淺綠色、圓形，孢子大小為（1.8×1.7）μm到（3.2×2.1）μm。菌絲長且少分叉，孢子多聚集在細長菌絲末端，菌株CoF3可能屬于毛霉屬。

圖2 病變紅提組織中分離情況圖

圖3 菌株CoF1的形態特征及孢子顯微形態圖

圖4 菌株CoF2的形態特征及孢子顯微形態圖

圖5 菌株CoF3的形態特征及孢子顯微形態圖

2.4 油茶餅粕多酚粗提物的抑菌作用

由表2可知，不同濃度的油茶餅粕多酚粗提取物溶液對實驗菌株都有抑制生長繁殖的作用，并且隨著粗提物濃度的逐步增大，抑菌作用也隨之提高，且對實驗菌種的抑制作用從強到弱依次為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞紅提致病菌CoF1＞紅提致病菌CoF2＞紅提致病菌CoF3。因此，茶多酚有較為明顯的抑菌作用。

表2 茶多酚粗提物的抑菌作用表

2.5 油茶餅粕多酚粗提物的最低抑菌濃度

由表3可知，油茶餅粕多酚粗提物水溶液抑制紅提致病菌CoF1、CoF2和CoF3生長繁殖的最小濃度為100.0 mg·mL-1，抑制金黃色葡萄球菌生長繁殖的最小濃度為25.0 mg·mL-1，抑制大腸桿菌生長繁殖的最小濃度為 50.0 mg·mL-1。

表3 茶多酚粗提物的最低抑菌濃度的測定表

2.6 作用時間對油茶餅粕多酚粗提物抑菌活性的影響

由表4可知，供試菌液與多酚粗提物溶液作用時間越長，其對供試菌種的抑菌率呈增強趨勢，即作用時間越長，其抑菌活性逐漸增加。對于同一作用時間，多酚粗提物溶液對于實驗細菌的抑菌活性從強到弱依次為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞紅提致病菌（CoF1、CoF2和CoF3）。

表4 作用時間對油茶餅粕多酚粗提物抑菌活性的影響表

2.7 作用溫度對油茶餅粕多酚粗提物抑菌活性的影響

由表5可知，油茶餅粕多酚粗提物在不同溫度下保溫，對多酚粗提物抑菌作用的影響并不明顯，其抑菌圈大小比較接近，可見茶多酚粗提物中活性成分較好且較穩定，可在需高溫處理的食品中作為保鮮劑。

表5 茶多酚粗提物溶液溫度對實驗菌株抑菌圈直徑的影響表（單位：mm）

3 結論

油茶餅粕多酚粗提物能夠較好地抑制分離出的紅提致病菌、金黃色葡萄球和大腸桿菌的生長繁殖，且油茶餅粕多酚粗提物的熱穩定性較好。油茶餅粕多酚粗提物與供試菌株作用時間越長，其對菌株的抑制作用越強。油茶餅粕多酚的抑菌性質能夠用于開發新型環保防腐劑，并且綜合利用油茶資源，期望通過本文的基礎研究，為未來開發出新型、安全、健康的多酚類食品保鮮劑奠定基礎。但本實驗提取所得多酚純度較低，而劉永青等[12]從蘋果渣中提取的多酚濃度為1 g·L-1時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較強的抑制作用，后續實驗可對多酚粗提物的純化進行更深的研究。