高效液相色譜法測定食用油中7種抗氧化劑的含量

食用油是人們生活中的必需品之一，但油脂極易被氧化，不宜長時間儲存，氧化不僅使食用油褪色、變色，還會破壞食用油中的維生素等營養物質，進而降低食用油的感官品質，使其變質，甚至產生有害物質，引起食物中毒[1]。因此在食用油生產過程中需要加入抗氧化劑。目前，食品抗氧化劑在食用油中的應用極為廣泛，常用的食品抗氧化劑種類有人工合成的叔丁基對羥基茴香醚（Butyl Hydroxy Anisol，BHA）、二丁基羥基甲苯（Dibutyl Hydroxy Toluene，BHT）、沒食子酸丙酯（Propyl Gallate，PG）、叔丁基對苯二酚（Tert-Butylhydroquinone，TBHQ）[2]。本實驗以上述4種常見的抗氧化劑為研究對象。此外，參考近年間白酒中檢測出塑料制品用塑化劑的報道，本實驗把食品接觸材料（塑料瓶）中的常見抗氧化劑也一起列入研究范圍[3]。食用油在長期儲存的情況下，盛裝容器添加的抗氧化劑有可能滲透或者遷移到食用油中，并隨著食品進入人體，對機體內正常的內分泌系統造成影響，干擾機體內激素的合成、釋放、運轉、代謝及結合的過程，有損血漿中正常激素水平的維持，故將塑料中常用的2,2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（抗氧化劑2246）、四（3,5-二叔丁基-4-羥基）苯丙酸季戊四醇酯（抗氧化劑1010）和三（2,4-二叔丁基苯基）亞磷酸酯（抗氧化劑168）這三種抗氧化劑作為補充研究對象，彌補食用油中抗氧化劑檢測的遺漏[4]。

目前，《食品安全國家標準 食品中9種抗氧化劑的測定》（GB 5009.32—2016）規定了食品中9種抗氧化劑的測定方法?！妒称啡萜?、包裝用塑料原料 第2部分：聚乙烯中抗氧劑和芥酸酰胺爽滑劑的測定 液相色譜法》（SN/T 1504.2—2017）規定了食品容器，包裝用塑料原料抗氧化劑的測定方法，而對于可能存在于食品中由塑料產品遷移到食品中的幾種常見抗氧化劑的測定尚未規定方法。

本文采用高效液相色譜法技術建立了一種簡單、快速測定食用油中多種抗氧化劑的方法。該方法具有較好的線性關系、精密度和回收率，還具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高和分析速度快等優點[5-10]?；谝陨蟽烖c選擇高效液相色譜法作為本實驗的檢測方法，為高效液相色譜法快速測定食用油中抗氧化劑試驗在普通實驗室的建立和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及耗材

1260 Infinify II高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Centrifuge 5804R高速離心機（德國Eppendorf公司）；ME 204電子天平（瑞士梅特勒.托利多公司）、-1100旋轉蒸發儀（日本EYELA公司）、超聲波清洗機（廣州吉普公司）、Milli-Q去離子水發生器（美國Millipore公司）。

甲醇（色譜純，美國賽默飛世爾科技公司）；乙腈（色譜純，美國賽默飛世爾科技公司公司）、Bond Elut C18柱（2 g，20 mL，120 μm，美國安捷倫公司）。

沒食子酸丙酯（CAS：121-79-9，純度：99.7%，Dr.Ehrenstorfer）；叔丁基對苯二酚（CAS：1948-33-0，純度：99.2%，Dr.Ehrenstorfer）；叔丁基對羥 基 茴 香醚（CAS：25013-16-5， 純 度：99.4%，Dr.Ehrenstorfer）；二丁基羥基甲苯（CAS：128-37-0，純度：100%，北京哈曼格生物科技公司）；2,2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（抗氧化劑2246）（CAS：119-47-1，純度：99.3%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；四（3,5-二叔丁基-4-羥基）苯丙酸季戊四醇酯（抗氧化劑1010）（CAS：6683-19-8，純度：98.2%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；三（2,4-二叔丁基苯基）亞磷酸酯（抗氧化劑168）（CAS：31570-04-4，純度99.05%，Dr.Ehrenstorfer）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別稱取沒食子酸丙酯（Propyl Gallate，PG）、叔丁基對苯二酚（Tert-Butylhydroquinone，TBHQ）、二丁基羥基甲苯（Dibutyl Hydroxy Toluene，BHT）、叔丁基對羥基茴香醚（Butyl Hydroxy Anisol，BHA）、四（3,5-二叔丁基-4-羥基）苯丙酸季戊四醇酯（抗氧化劑1010）、2,2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（抗氧化劑2246）、三（2,4-二叔丁基苯基）亞磷酸酯（抗氧化劑168）0.2 g（精確至0.000 1 g）于100 mL的容量瓶中，加入約5 0 mL乙腈，待完全溶解后再用乙腈定容至刻度，配制成濃度均為2 000 mg·L-1的標準品混合溶液。用乙腈稀釋成濃度分別為 0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1、100.0 mg·L-1和200.0 mg·L-1的系列標準工作液。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取1 g（精確至0.000 1 g）樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈溶液渦旋提取2 min，超聲30 min，8 000 r·min-1離心1 min，收集提取液于另一離心管中，待凈化。

將提取液倒入裝有約2 g無水硫酸鈉并經活化的C18固相萃取柱中，收集流出液，再用15 mL甲醇溶液洗脫萃取小柱，控制流速至每秒1～2滴，合并流出液與洗脫液于旋轉蒸發瓶中，于40 ℃下旋轉蒸發至近干，加2 mL乙腈復溶，充分溶解后過0.22 μm有機系濾膜，供液相色譜儀測定。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：X Bridge C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫：室溫；檢測波長：230 nm；進樣量：10 μL；流動相與梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件表

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取條件的優化

《食品安全國家標準 食品中9種抗氧化劑的測定》（GB 5009.32—2016）對于油類樣品的提取采用以正己烷溶解后加入乙腈萃取的方式進行?？紤]到本研究中作為食品包裝材料中常用的抗氧化劑2246、抗氧化劑1010和抗氧化劑168的極性小，萃取效果可能不理想，本研究直接用乙腈提取，并以加標回收的方式與國家標準方法進行對比，結果如圖1所示，兩種方法的PG、TBHQ、BHA、BHT的回收率接近，而按國家標準方法提取的抗氧化劑2246、抗氧化劑1010和抗氧化劑168回收率較低。

圖1 兩種提取方法的回收率對比圖

2.1.2 凈化條件的優化

考慮到食用油中組分相對復雜，研究人員通常用C18固相萃取柱對其進行凈化，本研究對是否過固相萃取柱凈化做對照實驗，取同一樣品分別以乙腈直接提取和按2.2前處理方法過柱凈化兩個方法處理后上機測定的色譜對比圖如圖2，如圖所示C18固相萃取柱的凈化效果良好。

圖2 提取后過柱與不過柱色譜圖對比圖

在確保待測物回收率不受影響的前提下盡量優化凈化效果，本文進一步做洗脫效果的對比實驗。對6個加標樣品按照前處理方法提取后，將提取液加至經活化的C18固相萃取柱，接收樣品流出液后再以每次5 mL甲醇多次淋洗C18固相萃取柱，將樣品流出液以及每次淋洗液分開收集濃縮后上機測定。6個樣品各個組分在各個流出液的平均回收率如表2所示。綜合考慮各個組分的洗脫情況，本研究采取將樣品流出液和15 mL洗脫液合并收集的方法。

表2 各組分的洗脫效果平均回收率對比表（單位：%）

2.2 方法學驗證結果

2.2.1 線性范圍及檢出限

按照上述標準溶液配制方法配制系列標準工作液，分別上機測定，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。7種抗氧化劑在質量濃度范圍0.5～200.0 mg·L-1內線性良好，再在空白樣品中加入適量的標準品混合溶液，按照上述的前處理方法處理加標樣品，根據色譜圖信噪比（S/N）＞3確定方法檢出限。本方法在濃度范圍0.5～200.0 mg·L-1內的線性方程、相關系數及檢出限見表3。

表3 各組分線性方程、相關系數及檢出限表

2.2.2 方法回收率和精密度

在空白樣品中加入標準物質，按上述前處理方法處理后測定，當添加水平為 5 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1時，回收率范圍為81.66%～95.58%，相對標準偏差（n=6）均小于10%，樣品加標圖譜見圖3，具體平均回收率及相對標準偏差見表4。

表4 各組分平均回收率及相對標準偏差表（n=6）

圖3 樣品加標圖譜圖

2.2.3 實際樣品測定

按照本方法對50個市售植物油進行檢測，其中2個樣品中檢出TBHQ，檢出含量分別為0.016 g·kg-1，0.072 g·kg-1。其他項目均未檢出。

3 結論

本文針對食用油中食品及食品包裝材料常見的7種抗氧化劑建立以乙腈提取、C18固相萃取柱凈化、高效液相色譜儀測定的檢測方法。本方法高效、準確、靈敏度好，適用于日常食用油中抗氧化劑的檢測。