高效液相色譜法測定醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ的含量

醬鹵肉制品是我國典型的傳統熟肉制品，是將牛肉、雞肉、鴨肉等畜禽肉及其可食副產品放入調制好的鹵水中燒煮而成的。因產品口感酥軟、風味濃郁，食用后唇齒留香、回味無窮，而深受消費者喜愛，各式各樣的鹵肉制品在市場、超市、小賣部等商鋪皆占有一席之地。一些商家為吸引顧客、增大銷量，在鹵制過程中添加違禁染料以增加產品色澤，讓食物看起來香艷可口，引起消費者的購買欲望。其中，酸性橙Ⅱ因其色澤鮮艷、著色穩定和價格低廉，極大可能被添加到產品中增色。酸性橙Ⅱ是一類偶氮染料，具有致癌作用，長期接觸這類染料會給身體健康帶來嚴重威脅。在2008年原衛生部發布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中指明，嚴禁將酸性橙Ⅱ作為著色劑用于鹵制熟肉制品[1]。

目前酸性橙Ⅱ的檢測方法有薄層色譜法[2]、酶聯免疫法[3]、高效液相色譜法[4-6]和液相串聯質譜法[7-8]。主要用到的前處理方式有固相小柱凈化[9-11]，分子印跡微萃取[12]、液液萃取[13]和基質分散萃取[14-15]等。根據國家監督抽檢細則，鹵肉制品中酸性橙Ⅱ的檢測按照SN/T 3536—2013標準進行，標準使用的方法是高效液相色譜法。本文將采用固相萃取柱凈化，優化前處理條件，高效液相色譜法測定醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ的含量，建立簡便、高效、重現性好的檢測方法，為檢驗部門提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（Thermo U3000）、氮吹儀（Evatros TCS）、振蕩儀（IKA）、超聲儀（Branson）、離心機（SIGMA）、渦旋振蕩器（IKA）、旋轉蒸發儀（RV 10 Auto）、pH計（梅特勒）、水浴鍋（HH-4）、超純水機（默克）。

氨水（分析純）、無水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、檸檬酸（分析純）、超純水（18.2 MΩ·cm）和石油醚（分析純）；酸性橙Ⅱ標準品：Bepure，250 mg，96.5%；固相萃取柱：氨基陰離子交換柱（Welchrom NH2，500 mg/6 mL）、聚酰胺柱（Cleanert JXA，500 mg/6 mL）、弱陰離子交換柱（Cleanert PWAX，500 mg/6 mL）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

準確稱取0.010 00 g標準品于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻得濃度為1 000 μg·mL-1的一級標準儲備液。準確移取1.00 mL的一級標準儲備液于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻得濃度為100 μg·mL-1的標準工作溶液。

1.2.2 試劑配制

1%氨水乙醇：1 mL氨水和70 mL無水乙醇混勻，用水定容至100 mL；5%氨水乙醇：5 mL氨水和70 mL無水乙醇混勻，用水定容至100 mL；10%氨水乙醇：10 mL氨水與70 mL無水乙醇混勻，用水定容至100 mL；20%氨水乙醇：20 mL氨水與70 mL無水乙醇混勻，用水定容至100 mL；5%氨水甲醇：5 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混勻；10%氨水甲醇：10 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混勻；15%氨水甲醇：15 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混勻；20%氨水甲醇：20 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混勻；20%檸檬酸溶液：稱取20 g檸檬酸用水定容至100 mL，混勻；2%甲酸水：移取2 mL甲酸用水定容至100 mL，混勻；0.02 mol·L-1乙酸銨溶液：稱取1.54 g乙酸銨用水定容至1 000 mL。

1.2.3 樣品前處理

（1）樣品預處理：按照四分法取樣，打碎磨細，-20 ℃保存，稱樣前需恢復至室溫。

（2）稱取2 g（精確至0.001 g）樣品，加入10 mL 20%氨水-70%乙醇水，超聲10 min，振蕩10 min，8 000 r·min-14 ℃離心5 min，取出上清液，重復提取一次，合并提取液，70 ℃氮吹至5 mL左右，用20%檸檬酸調pH為8，8 000 r·min-14 ℃離心5 min，待凈化。

（3）PWAX柱依次用3 mL甲醇和3 mL 2%甲酸水活化，取全部上述樣液過柱后，依次用3 mL 2%甲酸水、3 mL甲醇淋洗，柱抽干后，用9 mL 15%氨水甲醇分3次洗脫，收集洗脫液，50 ℃氮吹干，加入2 mL水復溶，0.45 μm濾膜過濾，待測。

1.2.4 液相色譜儀條件

色譜柱：C18柱Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；波長：484 nm；流速：1 mL·min-1；流動相比例：甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨溶液=65∶35；進樣時間：15 min。

2 結果與分析

2.1 提取試劑的選擇

分別采取4種不同比例的氨水乙醇水溶液對酸性橙Ⅱ加標樣品進行超聲、振蕩提取，50 ℃氮吹蒸干后復溶、過膜上機。上機結果顯示1%氨水乙醇水、5%氨水乙醇水、10%氨水乙醇水提取回收率在70%～80%，而20%氨水乙醇水提取回收率在90%以上，實驗表明20%氨水乙醇水的提取效果最佳，因此選擇20%氨水乙醇水為提取試劑。由于醬鹵肉制品蛋白質、脂肪含量高，提取前應先加入適量石油醚除脂，并于通風櫥中揮干再加入提取試劑，提取后選擇低溫離心以沉淀蛋白質，保證上樣樣液澄清，防止過柱時造成固相萃取柱堵塞。

2.2 濃縮方式的選擇

在提取試劑中加入標液混勻后分別選擇水浴、氮吹、旋蒸方式濃縮，其中分為60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴濃縮，50 ℃、60 ℃、70 ℃氮吹濃縮，常溫、30 ℃、40 ℃旋蒸濃縮。實驗發現，60 ℃、80 ℃水浴濃縮耗時長，回收率在50%～60%，100 ℃水浴濃縮雖然速度快但回收率只有30%；50 ℃、60 ℃氮吹耗時較長，70 ℃氮吹耗時相對較短，且3個溫度下回收率皆在90%以上；常溫、30 ℃旋蒸時間長，40 ℃旋蒸容易爆沸，加壓后沖上連接管，使樣液損失，而樣液流回雞心瓶會造成樣品間污染，不適用于該樣液濃縮。因此，選擇70 ℃氮吹為提取液濃縮方式。

2.3 固相萃取柱的選擇

固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）是目標物通過在吸附劑填料中選擇性保留與選擇性洗脫從而實現凈化的一種分離技術。實驗研究加標樣液在相同條件下分別使用氨基陰離子交換柱（NH2）、聚酰胺柱（JXA）、弱陰離子交換柱（PWAX）3種固相小柱進行凈化，濃縮后復溶上機。結果顯示使用氨基陰離子交換柱的回收率在20%～40%，使用聚酰胺柱的回收率在30%左右，而使用弱陰離子交換柱的回收率可達60%以上。為了進一步分析各小柱凈化過程中對目標化合物的保留、洗脫效果，分別收集過柱后樣液、淋洗液、洗脫液濃縮后上機，上機濃度結果見表1。

表1 溶液中酸性橙Ⅱ上機濃度結果表

分析表1實驗結果可知，氨基陰離子交換柱對上樣樣液保留效果差，聚酰胺柱上樣后使用2%甲酸水淋洗會造成損失，而過弱陰離子交換柱后的樣液、淋洗液中均未檢出目標物，說明該柱對目標物的選擇性高、保留效果好，因此實驗選擇PWAX柱作為酸性橙Ⅱ的凈化柱。

2.4 pH對固相萃取柱吸附與洗脫的影響

PWAX是一種聚合物基質吸附劑，雖然pH適用范圍廣（0～14），但針對特定目標物也有最適pH值，需研究上樣樣液pH對PWAX柱保留性及后續洗脫效果的影響。將上樣樣液分別調pH至2、4、6、8，上樣后，收集過柱后樣液、淋洗液，吹干后復溶上機，結果均未檢出目標物，表明PWAX的吸附能力受pH影響小。進一步分析洗脫液用量對洗脫效果的影響，上樣后先后使用2%甲酸水和甲醇淋洗，同時收集淋洗液，氮吹干復溶上機，結果顯示未出峰，說明淋洗不會造成損失。對上述采用4種不同pH上樣樣液的固相萃取柱分別用10%氨水甲醇進行多次洗脫，并分別收集每次洗脫液，氮吹干復溶上機，上機濃度結果見表2。

表2 各洗脫液中酸性橙Ⅱ上機濃度結果表

分析表2實驗結果可知，當上樣樣液pH=2、pH=6、pH=8時，相同堿性的洗脫液用量相同（10 mL）的情況下，目標化合物回收率均在70%以上，考慮到上樣前調pH至2、6時檸檬酸溶液用量大，上樣量增多，上樣時間增加，為節省實驗時間，提高效率，上樣前調pH至8較為合適。

2.5 洗脫液的選擇

弱陰離子交換柱，洗脫液通常選用氨水甲醇進行洗脫。為達到更好的洗脫效果，本研究采取4種濃度的氨水甲醇對固相萃取柱進行洗脫，結果表明5%氨水甲醇、20%氨水甲醇洗脫效果一般，而10%氨水甲醇、15%氨水甲醇洗脫效果均較好，回收可達到80%以上，但10%氨水甲醇需20 mL才能將目標物全部洗脫下來，而15%氨水甲醇只需9 mL即可將目標物全部洗脫，相對于10%氨水甲醇用量大大減少。因此，采用15%氨水甲醇作為固相萃取柱的洗脫液。研究發現少量多次洗脫比單次大量洗脫效果更好，所以實驗采用9 mL 15%氨水甲醇分3次洗脫，且每次洗脫后都要抽干小柱。

2.6 線性范圍及檢出限

分別準確吸取適量酸性橙Ⅱ標準儲備液（100 μg·mL-1），用水稀釋配制成濃度為 0.1 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1和 10.0 μg·mL-1的標準工作液，按照設定的液相儀器參數進樣，以酸性橙Ⅱ色譜峰面積（y）對酸性橙Ⅱ質量濃度（x）作標準曲線，得酸性橙Ⅱ的線性方程為y=0.358 3x，相關系數R2為0.999 9。結果表明，酸性橙Ⅱ在0.1～10.0 μg·mL-1線性良好。以3倍信噪比為檢出限（Limits Of Detection，LOD），當取樣量為2 g時，酸性橙Ⅱ的方法檢出限為0.1 mg·kg-1，滿足檢測的要求。

2.7 回收率及精密度

為驗證方法的可行性，稱取2 g陰性樣品，分別添加 0.1 mg·kg-1、0.2 mg·kg-1和 1.0 mg·kg-13 個濃度水平，每個水平做6個平行實驗，結果見表3。酸性橙Ⅱ在3個添加水平的回收率在80.0%～97.5%，相對標準偏差（RSD）小于5%（n=6）。實驗結果表明該方法具有較好的回收率與精密度，滿足醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ測定的要求。

表3 酸性橙Ⅱ加標回收率和精密度（n=6）結果表

2.8 實際樣品測定

對東莞市監督抽取的30份各類醬鹵肉制品（包括醬牛肉、鹵雞翅、鹵鴨腳等）進行檢測，均未檢出陽性樣品。雖然暫未檢出陽性樣品，但食品安全問題不容忽視，食品監管部門仍需加強抽檢。

3 結論

本研究建立了固相萃取凈化、高效液相色譜測定醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ含量的方法。研究發現若在樣品提取前先加入石油醚除去油脂，過柱前先采用低溫高速離心沉淀蛋白質，可以得到較澄清的上樣液，過固相萃取柱時，不會堵塞填料，從而提高凈化效率。經過旋蒸、水浴兩種濃縮方式實驗對比，發現70 ℃氮吹濃縮可同時處理大批量樣品，減少交叉污染，降低目標物損失，可保證整個實驗的高效性與準確性。研究采用弱陰離子交換柱對樣液進行凈化，可大大提高對酸性橙Ⅱ的吸附保留作用，增大洗脫液堿性與少量多次洗脫，不僅減少試劑使用量、縮短洗脫時間還能保證洗脫效果。研究通過優化前處理條件，縮短實驗時間，減少試劑使用量，而提高檢驗工作效率。本方法便捷、高效、節能，為食品檢測部門測定醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ的含量提供參考。