瓊脂覆蓋法防止菌落蔓延生長的可行性探究

田 霞，王春林，余 為，劉琪雯

（重慶市黔江食品藥品檢驗所，重慶 409003）

菌數總數作為食品微生物學檢測的基礎項目，對食品安全起著至關重要的作用。菌落總數可以用來判定食品被細菌污染的程度及衛生質量，反映食品在生產過程中是否符合衛生要求，以便對被檢樣品做出適當的衛生學評價[1]。如果食品菌落總數超標，說明該食品的衛生質量達不到基本的衛生要求，因為大量的細菌能夠破壞食品中的營養成分，加速食品的腐敗變質。隨著食品工業的發展，食品種類更加豐富，生產原料品種來源更廣泛，加工工藝也更復雜，但微生物的污染仍然無法避免，尤其是糕點、面點等含高淀粉類食品受芽孢桿菌污染的概率大[2-5]，產品加工過程中滅菌不徹底，菌落計數時平板上容易出現菌落彌漫生長的現象，導致菌落無法計數，對菌落總數檢驗項目的準確性造成嚴重的影響[6]。本文采用瓊脂覆蓋法，即在樣品和培養基混勻凝固后，再在其表面加蓋一薄層（約4 mL）平板計數瓊脂培養基，通過對比不覆蓋檢驗方法，對覆蓋法的有效性進行探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

月餅：重慶渝東南片區（黔江、彭水、酉陽、秀山）市售月餅50批，其中廣式月餅47批，滇式月餅2批，臺式月餅1批。

培養基：磷酸鹽緩沖液（201108），購自北京陸橋技術有限責任公司；平板計數瓊脂培養基（211201），購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9162電熱恒溫培養箱，上海和呈儀器制造有限公司；HH.B11-500-BS-Ⅱ 電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；LDZM-80KCS-III立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基及樣品制備

按照國家標準《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）進行檢測，無菌稱取樣品25 g加入225 mL的無菌磷酸鹽緩沖液中，即得到1∶10的稀釋樣品勻液，再無菌吸取1∶10樣品勻液1 mL加入9 mL無菌磷酸鹽緩沖液中，即得到1∶100的稀釋樣品勻液，依次制備10倍系列稀釋樣品勻液1∶1 000、1∶10 000。每次遞增一個稀釋度，更換1 mL無菌的刻度吸管，估計樣品的污染狀況程度，選擇3個連續的稀釋度，每個稀釋度覆蓋組做2個平板，不覆蓋組做2個平板。同時做空白對照組，即吸取無菌稀釋液1 mL至無菌平皿內，做兩個平板。提前制備好平板計數培養基，放置于48℃±2℃恒溫箱中保溫，及時傾注轉動平皿，使樣品勻液與培養基充分混勻，覆蓋組在培養基凝固后再均勻傾蓋約4 mL培養基。在短時間內完成樣品的取樣、稀釋以及平板制備。

1.3.2 菌落培養及結果觀察

所有平板均倒置放于電熱恒溫培養箱中36 ℃培養48 h，觀察結果并進行計數，記錄對應的稀釋倍數與菌落數量。菌落結果選取個數在30～300 CFU、無蔓延生長情況的平板計數，個數小于30的平板則記下具體菌落個數，個數大于300的平板記結果為多不可計；若出現較大片狀菌落生長的平板時，則不能采用，以另一個無片狀生長的平板的菌落個數作為此稀釋度的菌落數；若菌落蔓延的生長未占到一半的平板，而剩下的一半平板菌落又很均勻地分布，則可以用均勻分布的半個平板的菌落數乘以2，作為這一個平板的菌落總個數。菌落總數結果以稀釋度平均數乘以稀釋倍數表示，即每克中菌落總數個數（CFU·g-1）。

1.3.3 實驗設置

（1）不加覆蓋組。按照國家標準檢測，制成檢驗培養基平板后培養基不加覆蓋。

（2）加覆蓋組。按照國家標準檢測，制成檢驗培養基平板后，再在其表面加入一薄層平板計數瓊脂培養基（約4 mL），即加覆蓋。

（3）空白對照組。按照國家標準檢測，覆蓋和不覆蓋均做兩個平板。覆蓋組和不覆蓋組生長結果均為無菌生長，則此次試驗有效。

2 結果與分析

計數每個樣品各個稀釋度、兩個組的檢驗平板的菌落蔓延情況，再計數不蔓延檢驗平板的菌落數量?？瞻讓φ战M平板均無菌落生長。50批月餅樣品均為熱加工工藝，兩組均有5批月餅菌落總數小于10 CFU·g-1，1批月餅菌落總數值110 000，大于《食品安全國家標準 糕點、面包》最高安全限量（M=100 000 CFU·g-1），產品菌落總數項目不符合國家限量標準，即不合格。檢驗平板蔓延均出現在1∶10稀釋度，蔓延生長的月餅樣品地方派式有廣式和滇式，此次覆蓋組與不覆蓋組的菌落總數檢測結果中位值均為150，50批樣品基本信息及菌落總數檢測結果情況見表1。統計50批月餅樣品覆蓋與不覆蓋組菌落蔓延情況，見表2。

表1 50批樣品基本信息及菌落總數檢測結果情況表

表2 50批月餅樣品覆蓋與不覆蓋組菌落蔓延情況統計表

從表2中可以看出覆蓋組和不覆蓋組兩種檢驗方法有顯著性差異，不覆蓋組出現菌落蔓延情況比較嚴重，蔓延平板占比34%，覆蓋組能很大程度控制菌落蔓延生長，蔓延平板占比降低為12%。蔓延生長的平板在菌落結果計數有時不宜采用，有時以平板的一半菌落數乘以2計數，極大地影響了菌落總數的準確計數。雖然實際應用中依然有個別平板蔓延生長的情況出現，但總體而言，覆蓋法能有效改善平菌落蔓延生長問題，研究人員在實際工作中可以適當采用。

3 結論與討論

月餅作為我國特有的傳統焙烤食品，其因含有豐富的營養物質在生產和儲存期間極易受微生物污染而腐敗變質。菌落總數作為食品檢測基礎性指標，一定程度上能反映月餅的食品衛生質量情況。從近年來市售月餅質量抽查結果中可以看出，菌落總數是月餅質量的主要安全問題之一[7]，且市售月餅的菌落總數項目合格率很難大幅度提高[8]。市場上消費較多的廣式月餅含有的優勢細菌是芽孢桿菌和球菌[9]，而芽孢桿菌極易引起菌落總數測定時蔓延生長，影響菌落總數結果的準確計數。有研究指出可以在瓊脂中加入0.2%～0.3%的TTC防止菌落出現彌漫現象[10]。也有研究發現檢驗平板做好后再在其表面覆蓋5 mL瓊脂質量分數為2.0%的培養基（配方：瓊脂20 g，水980 g），比在培養皿皿蓋中放置兩層濾紙的方法和每100 mLPCA培養基中加入2.5 mL 0.1%TTC溶液混勻的方法更能降低菌落蔓延對檢驗結果的影響[11]。國家標準《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2022）即將實施，相較于2016年版，其菌落總數結果報告中刪除了“若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延”這一項情況，這要求檢驗員更為準確地預判樣品中是否含有在培養基表面蔓延生長的菌落，從而選擇適宜的菌落總數測定方法。培養基的菌落蔓延生長是由于培養基表面游離水而助力細菌游動所形成，各個文獻方法均是旨在減少其影響，從而降低菌落蔓延生長情況。本次研究中的覆蓋法能大大減少平板菌落蔓延生長的情況出現，但此次研究食品種類較為單一，以后的研究可以擴大食品類別。覆蓋法不失為一種簡便有效降低菌落蔓延生長的方法，但仍然有個別平板蔓延情況發生，導致菌落計數不準確，實驗人員可依據檢驗產品和目的選擇合適抑制菌落蔓延生長的檢驗方法。